撰文 | 木蘭之枻
責編 | 兮
超過半數的人類遺傳病可歸因於基因組的點突變，而近半數的致病點突變屬於C·G--T·A鹼基突變【1】，這其中兒童早衰症（Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS）（牛昱宇/龍承祖/劉光慧/季維智合作建立首例人類兒童早衰症基因編輯猴模型）非常具有代表性：絕大多數早衰症患者（>90%）的發病歸因於LMNA基因序列第1824位點的C·G--T·A鹼基突變，該突變會破壞LMNA基因mRNA的正常剪接過程，導致毒性截短蛋白progerin的出現。Progerin蛋白會干擾LMNA編碼的正常核纖層蛋白功能，呈現出負顯性突變效應（dominant-negative），最終導致LMNA基因雜合突變攜帶者出現早衰症【2,3】。
目前早衰症依然缺乏有效的治療手段，而要直接修復致病點突變實現早衰症的根治更是難上加難。研究者曾嘗試採用CRSIPR-Cas9技術敲除LMNA基因的致病拷貝，但這有破壞LMNA基因野生型拷貝的風險，難以用於臨床治療【4-6】。近年來，可實現A·T--G·C鹼基對轉換的新型單鹼基編輯器ABE（Adenine Base Editor）的出現，讓早衰症治療有了新的希望【7】（詳見：突破丨Nature長文發表基因編輯最新成果——無需切割DNA也能自由替換ATGC）。理論而言，ABE能夠直接逆轉早衰症的致病點突變（c.1824 C>T）實現早衰症的根治。
2021年1月6日，來自哈佛大學Broad研究所的David R. Liu實驗室與NIH美國國家人類基因組研究所（NHGRI）的Francis S. Collins實驗室以及範德堡大學醫學中心的Jonathan D. Brown實驗室合作在Nature發表題為In vivo base editing rescues Hutchinson–Gilford progeria syndrome in mice的論文。文章證實了單鹼基編輯工具ABE在早衰治療中的巨大潛力。研究指出，在低脫靶風險的條件下，ABE能直接逆轉早衰小鼠模型中的致病點突變並明顯改善模型的多種症狀，且單次注射攜ABE的AAV病毒便能顯著延長其壽命。
研究伊始，根據致病點突變LMNAc.1824 C>T在基因組中的位置特徵，研究者選取PAM序列為NGA的SpCas9突變體SpCas9-VRQR構建適用於早衰症治療的單鹼基編輯系統ABEmax-VRQR。隨後研究者選取兩名早衰症患者的上皮細胞驗證ABEmax-VRQR修復效率。結果顯示，患者上皮細胞中，ABEmax-VRQR對LMNA c.1824 C>T致病點突變的修復效率均超過80%。此外，修復後的上皮細胞中LMNA基因mRNA的異常剪接和毒性截短蛋白progerin的水平均明顯降低，而正常核纖層蛋白的表達水平有部分恢復，細胞核形態也有明顯改觀。
已有研究指出，單鹼基編輯工具ABE在DNA水平和RNA水平均有不同程度的脫靶風險。為此，研究者在患者上皮細胞中對ABEmax-VRQR的脫靶風險進行系統分析，結果顯示其脫靶風險非常有限，具有很高的安全性。
隨後研究者選用純合的轉基因早衰小鼠模型（C57BL/6-tg(LMNA*G608G)HClns/J）開展後續的基因治療實驗。該模型具有早衰症的核心表型，包括血管平滑肌細胞(VSMC) 缺陷、脫毛、皮下脂肪缺失、肌肉骨骼異常和壽命縮短。目前在體基因治療中安全性最高的病毒遞送系統是AAV系統，研究者早前也已開發出基於AAV遞送系統的ABE治療工具。考慮到早衰小鼠模型的多種組織和器官均有明顯異常，研究者選擇具有多組織感染能力的AAV9亞型用於ABEmax-VRQR的遞送以開展治療實驗，給藥方式則選擇後眼窩給藥（P3和P14給藥）和腹腔注射給藥（P14給藥）兩種方式。
研究者首先對早衰小鼠模型中的點突變修復效率進行評估。結果顯示，P14治療的修復效率要優於P3，這或是因為P14小鼠可注射的病毒量更多。研究還指出，單次AAV病毒注射便能取得較好的修復效果：六周齡小鼠的不同組織中，致病點突變的修復效率可達10-60%。
隨後研究者對治療後的小鼠進行長期觀察以評估治療效果。結果發現，六月齡小鼠不同組織中的致病點突變修復效率較六周齡小鼠有明顯的提高，表明ABE的治療具有持久性。此外，六月齡小鼠各組織中毒性截短蛋白progerin在RNA水平和蛋白水平均有明顯減少，進一步證實了ABE治療的有效性。
研究者還對治療後早衰小鼠的各種表型進行了系統評估。血管平滑肌細胞(VSMC)缺陷方面，六月齡時，P3治療能明顯增加截面中VSMC的數目，但對其外膜厚度無明顯改善；而P14治療則能完全修正VSMC的數目和外膜厚度的缺陷。此外，免疫螢光染色結果顯示，P14治療後，六月齡小鼠動脈中VSMCs的數目有明顯恢復，核纖層蛋白表達恢復正常且幾無毒性蛋白progerin的表達。最後，小鼠壽命分析結果表明，單鹼基編輯治療能顯著延長早衰小鼠模型的壽命：P3治療的早衰小鼠壽命從189天延長至337天，而P14治療的早衰小鼠壽命從215天延長至510天。
研究者注意到，5/9隻（9隻衰老死亡小鼠的屍檢中，5隻發現了肝癌）接受AAV治療的小鼠患有肝癌。隨後的全基因組測序指出，AAV病毒會整合進基因組中，因此存在一定的安全風險。不過全基因組測序分析和ATAC-seq分析則表明，單鹼基編輯工具ABE本身並無明顯的安全風險，肝癌的發生很可能與ABE工具無關。此外，考慮到本研究中的早衰小鼠模型是轉基因模型，除攜帶人員的突變型LMNA基因外，還攜帶有促肝癌風險的人源RAB25基因，因此，單鹼基編輯治療早衰的安全風險仍有待進一步探索。
總體而言，本研究利用單鹼基編輯技術ABE成功地實現了早衰小鼠模型的基因治療，這為單鹼基編輯工具在基因治療領域的應用奠定了堅實的基礎。這一研究在細胞和動物水平系統性的評估了ABE系統的治療效果和安全風險，這也將更好的指導單鹼基編輯工具的優化與改進，為其臨床轉化應用指明了方向。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41586-020-03086-7
參考文獻
1. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet(2018).
2. Eriksson, M. et al. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nature423, 293–298 (2003).
3. De Sandre-Giovannoli, A. et al. Lamin A truncation in Hutchinson–Gilford progeria. Science300, 2055 (2003).
4. Beyret, E. et al. Single-dose CRISPR–Cas9 therapy extends lifespan of mice with Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nat. Med.25, 419–422 (2019).
5. Santiago-Fernández, O. et al. Development of a CRISPR/Cas9-based therapy for Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nat. Med. 25, 423–426 (2019).
6. Suzuki, K. et al. Precise in vivo genome editing via single homology arm donor mediated intron-targeting gene integration for genetic disease correction. Cell Res. 29, 804–819 (2019).
7. Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of AT to GC in genomic DNA without DNA cleavage. Nature551, 464–471 (2017).