克隆中載體的處理和去磷酸化

2021-01-10 生物谷
應加入常用量5～10倍的內切酶水解載體，以保證載體被完全酶切；

 

 

(2)如用雙酶切割載體，則必須電泳回收載體片段，除去雙酶切所產生的小DNA片段； (3)如粘端連接,單酶切處理過的載體必須用

 

鹼性磷酸酶(如牛小腸鹼性磷酸酶，CIP)處理，防止載體自身環化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。對於3末端突出的DNA(如

〖ＷＴ５ＢＸ〗Pst〖ＷＴ５ＢＺ〗I水解，需用10倍於5末端突出DNA(如〖ＷＴ５ＢＸ〗Eco〖ＷＴ５ＢＺ〗RI,〖ＷＴ５ＢＸ〗

Hin〖ＷＴ５ＢＺ〗dⅢ)的CIP進行去磷酸化，以達到最少的載體自身環化。

 

去磷酸方法如下：

 

①DNA加入10倍去磷酸化緩衝液，5端突出的DNA，每100pmol 5磷酸基團加入1個單位的CIP，37℃反應30分鐘。平末端或3端突出的

 

DNA，每2pmol 5磷酸基團加1個單位CIP，37℃保溫15分鐘後，再加CIP，55℃反應45分鐘(2μg 5kb的線性DNA約含14pmol左右的5磷

酸基團)；

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分別至終濃度05%、 5mmol/L和50μg/ml，混勻後56℃反應30分鐘；或加EDTA(pH8.0)至終濃度為

5mmol/L，65℃保溫1小時或75℃，10分鐘滅活CIP;

③冷卻至室溫後，加入等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次;

 

④乙醇沉澱，離心，抽乾，溶於無菌去離子水，濃度最好為100μg/ml,-20℃保存備用。〖ＨＴ５Ｈ〗 10倍CIP去磷酸化緩衝液：

〖ＨＴ〗〖JZ(Z〗10 mmol/L ZnCl210 mmol/L MgCl 2100 mmol/L Tris·HCl,pH8.0。

 

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