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檢測磷酸化蛋白的抗體是針對該蛋白的特異性磷酸化位點的,而檢測總蛋白的抗體一般針對的是該蛋白別的位點,故而磷酸化抗體檢測不到總蛋白,而總蛋白抗體能檢測包括磷酸化和未磷酸化蛋白在內的目的蛋白。磷酸化蛋白的Western Blotting檢測是信號通路研究中的經典方法。
本文根據丁香通llllcjchina站友的【做磷酸化蛋白的western blot之我見】一文詳細總結了操作過程中的注意的事項,供剛入門的同仁們參考:
1. 一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑,還要加入一定量的磷酸酶抑制劑,否則即使band壓出來也會很淺,結果也不可信。
附:lysis buffer配方
Buffer
Company Cat.No.
Stock
Working 100ml
MW
g/100ml
ml
Tris
1.080382.2500(Merck)
121.14
1M
12.114
5
NaCl
31434(Riedel-deHaen)
58.44
5M
29.22
3
NP-40
I-3021(Sigma)
10%
10
10
Sodium deoxycholate
D6750(Sigma)
414.6
10%
10
2.5
EGTA.4Na
E8145(Sigma)
468.3
0.25M
11.7075
0.4
Protease inhibitors
Aprotenin
A6279(Sigma)
10mg/ml
0.1
Leupeptin
10mg/ml
0.1
PMSF
100mM
1
Phosphatase inhibitors
b-glycerophosphate
1M
1
Na3VO4
S6508(Sigma)
183.9
200mM
3.68
0.5
NaF
1.06449(Merck)
41.99
0.5M
2.0995
0.2
H2O
78.2
說明:
(1) Na3VO4要活化:Activation ofSodium Ortho Vanadate
a. Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O。
用ddH2O配製200mM濃度的原礬酸鈉(3.68克原礬酸鈉加入100ml ddH2O中)
b. Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl (the starting pHvaries depending on the lot of the chemical)。At pH 10.0the solution is yellow。
以1M NaOH 或1M HCl調整pH值至10.0,此時溶液呈黃色。
c. Boil the solution until it turnscolorless (about 10 mins)。
煮沸直至溶液變為無色。
d. Allow solution to cool to roomtemperature。
冷卻至室溫。
e.Readjust pH to 10.0 and repeat steps c & duntil the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store inaliquots at -20°C。
重調pH值至10.0,重複c、d兩步,直到變為無色且pH值穩定至10.0,分裝保存在-20°C。
NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, convertingit to a more potent inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J.Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.
(2) 我的配方配的是100ml 細胞裂解液,但如您各個成分的體積加起來,會發現total=102.1ml,那是因為這些成分加在一起後總體積會縮小的。
(3) lysis buffer的使用方法:
a. 細胞用typsine消化下來後,PBS洗2次(1500rpm,離心5min),然後加適量lysis buffer(1×107個細胞約用200ul,但建議根據自己的實驗條件調整ul數,使後來測定的蛋白濃度在5-10ug/ul左右,但不需要太精確)。冰浴30min(中間最好vortex一下),然後12000rpm,4度,離心15min,取上清,然後進行後繼實驗如測定蛋白濃度等。
b. 保存在-80℃冰箱可以保證蛋白磷酸化的程度不受影響。提取蛋白時,組織要在液氮中研磨成粉狀(研缽也要先在低溫下保存,而且要保證研缽周圍不掛水珠,這才能真正保證低溫。),將粉末轉移到ependoff管中後加適量lysis buffer裂解,之後的處理跟細胞的類似。要特別注意,要讓組織保持低溫,以保證蛋白不會脫磷酸化。
(4) 把抑制劑配成stock後,再把抑制劑全部加入到裂解液中混合,保存於-20度。
一般配40-50ml,分裝成10ml每管,所有試劑都加好的,用時取出,用完再放回-20度冰箱。我使用時沒有問題,至少在冰箱中放了兩三個月。酶的抑制劑是不太穩定,但我的配方中抑制劑是過量的,所以問題不大。我不採用使用前再加抑制劑是因為避免忘記加抑制劑,或者即使加了抑制劑也容易使實驗多一個步驟,容易造成混亂。
2. 加一抗後最好4度過夜,保證抗體有充分的結合時間。因為磷酸化的蛋白只佔總的蛋白量的極少部分。4度也可使一抗重複使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時即可。
3. 磷酸化抗體的好壞是一個關鍵因素,所以要選擇好的廠商。個人認為,Cell signaling公司做的磷酸化抗體不錯,尤其是MAPKs磷酸化抗體。
4. 最好根據廠商的protocol來操作實驗,這是實驗成功的保證。如Cell signaling會建議用含5%BSA的TBST稀釋phospho-p38等抗體,效果不錯,而不是用常見的含5%non-fat milk的TBST。
5. 抗體的稀釋倍數也要適當。不同廠商也會有不同要求。
6. 研究完某一蛋白的磷酸化情況後最好也要研究一下該蛋白總的表達量。這樣才有更強的說服力,可以區分磷酸化水平的增加是因為總的蛋白表達增加,還是因為沒有改變總蛋白,只是磷酸化水平增加了。如壓完phospho-p38抗體後,我會把相同的membrane做strip後再壓p38,然後再strip一次,再壓內標actin。
補充:正如我上面所說的,「研究完某一蛋白的磷酸化情況後最好也要研究一下該蛋白總的表達量」。這有兩種方法,一是:相同的sample在不同的well中上樣兩次(可在相同的gel上,也可在不同的gel),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個gel,壓內標。但是本人不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。因此,比較公認的,本人也建議如此的方法,即:將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去(strip)。
1)Strip Solution(Stripping Buffer,膜再生液)如下:常溫密閉保存(有臭雞蛋味道),能放很久,幾個月不成問題。
2)Strip方法
準備一硬塑料盒,倒入strip solution,將膜完全浸泡(或者將膜與strip buffer封入塑料薄膜中,完全浸入水浴鍋中,使四周都能接觸恆溫水),50度水浴30min,用TBST洗5分鐘,3次即可去除已孵育結合的抗體。信號會均勻地減弱些許,但不會造成差異。
許多人會建議55度水浴30min。Strip solution是用來去除已結合的抗體,但也會去除部分的蛋白,導致蛋白信號變弱。我本人經實驗發現水浴時有時溫度不穩定,溫度定為55度時往往其溫度容易超過,導致較多的蛋白也被去除,故建議溫度設為50度30min,既能有效去除已結合的抗體,又比55度更能保護蛋白.
3)另外一個Strippingbuffer的配方:
4)Strip時一定要注意:
membrane一定要完全泡在strip solution中(可用較硬的塑料膜封好),然後要完全浸入水中,使受熱均勻。這一點很重要,要不然,隨後壓出來的總蛋白也好,內標也好,就會不均一,無法進行比較。我曾將同一張membrane用我提供的方法strip了3次,分別壓不同的抗體(因為有時候蛋白分子量很接近),效果都不錯。
7. 做磷酸化蛋白WB時,除了目標蛋白的band以外,往往會出現非特異性的band。磷酸化抗體不好的話,甚至會壓出非特異性的band,而沒有你想要的band,所以壓片以後,你一定要根據markers比對一下,你壓出的band分子量是否正確。我以前壓WB時,壓出了一條band,就以為是我想要的那條,然後還根據趨勢推測可能的機制,走了不少冤枉路。還有一次,把markers的分子量記錯了,比對出來的結果當然也不對。
8. 磷酸化蛋白WB時backgroud也往往較深,所以壓片時間要適當,不能太長或過短,太長則backgroud太深,蓋住想要的那條band,時間過短則可能沒有band或者band太淺。
9. 磷酸化蛋白WB時,用TBST洗時也要注意一下,搖床的轉速不要太快,洗的時間不要太長,孵育一抗和二抗之後分別洗5min 3次即可,寧願background深一些,總比做不出來強得多。另外,洗的時候,最好不要把幾張membrane疊在一起洗。
10. 磷酸化蛋白Western blot高背景的可能原因
(1) 磷酸化蛋白抗體本身特性造成的,這一點除了換抗體,否則無法改善。
(2) Nitrocellulose/PVDF膜質量不高。
(3) ECL螢光發光劑質量不高。
(4) 封閉時要用含5%non-fat milk的TBST,室溫1小時,時間不宜過長。
(5) 加入一抗後要4℃過夜。而且一抗要用合適的buffer稀釋,一定要根據抗體公司的protocol建議之buffer稀釋。就Cell signaling公司的抗體而言,大部分抗體要用含5%BSA的TBST稀釋,如改用5%non-fat milk的TBST稀釋,除了造成高背景以外,還很容易使抗體不穩定,重複利用的次數會明顯下降。當然,Cellsignaling公司也有用5%non-fat milk的TBST稀釋的抗體,如PARP antibody (#9542)。
(6) 另外,還要確定二抗是否合適。比如,用相同的二抗壓其它抗體時,是否也有相同的高背景。
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