Cancer Cell: 激酶組+磷酸化蛋白組揭示小細胞肺癌治療的潛在靶點

2021-01-11 中科新生命蛋白代謝組

每年全球有20萬人死於小細胞肺癌（SCLC）。SCLC腫瘤具有獨特的生物學特性，增殖和轉移潛力很高且預後差。SCLC腫瘤的DNA和RNA測序鑑定出的可治療的靶標很少，因此尋找SCLC治療靶點變得尤為重要。

2020年7月，美國史丹福大學Julien Sage團隊在《Cancer Cell》(IF=26.6)上發表了題為"Unbiased Proteomic Profiling Uncovers a Targetable GNAS/PKA/PP2A Axis in Small Cell Lung Cancer Stem Cells"的研究論文，利用激酶組、RNA-seq、互作組、磷酸化蛋白質組等方法確定蛋白激酶A（PKA）和PKA信號通路中的分子是小細胞肺癌起始和進展的關鍵調節劑，可作為SCLC潛在治療靶點。

研究材料：

1. 激酶組：3種SCLC患者來源的異種移植模型（PDXs）、8種同種異體移植模型（從自體小鼠模型中分離出來）、非小細胞肺癌（NSCLC）樣品（2種肺腺癌PDXs、1種鱗狀肺癌PDX和4種單腫瘤來源的同種異體移植模型）、正常鼠肺組織；

2. RNA-seq：臨床樣本：81例SCLC腫瘤；PDX模型：NJH29-GFP+Dox組和NJH29-aPKA+Dox組

3. 互作組：NCI-H446細胞，PKA-Cα、PKA-Cβ和PKA-R1A分別拉下來的蛋白複合物；

4. 磷酸化蛋白質組：NCI-H526細胞和NCI-H69細胞；cAMP的長效類似物（8-Br-cAMP）處理組和對照組。

技術方法：

激酶組，RNA-seq，互作組、磷酸化蛋白組

實驗路線圖

研究結果

1. 激酶組：篩選活性激酶，鎖定目標PKA

使用多重抑制劑珠（MIB）柱來富集SCLC中的活性激酶，將3種SCLC患者來源的異種移植模型（PDXs）和8種同種異體移植模型（從自體小鼠模型中分離出來）與非小細胞肺癌（NSCLC）樣品（2種肺腺癌PDXs、1種鱗狀肺癌PDX和4種單腫瘤來源的同種異體移植模型）進行了比較，正常鼠肺用作對照。確定了20種在SCLC中比在正常肺或NSCLC中更有活性的激酶，其中，PRKACA編碼PKA-Cα（PKA催化亞基α）。結合激酶的功能和已有的研究報導，作者將目標聚焦到PKA。進一步利用RNA-seq、組織晶片和免疫印跡等技術證實PKA在人類SCLC中表達並活躍。

MIB 激酶組分析可識別SCLC中的PKA和其

2. PKA功能研究：SCLC的增長需要PKA

將TKO小鼠與Prkaca條件等位基因敲除小鼠雜交，獲得PrkacaM120A小鼠，與對照TKO小鼠相比，PrkacaM120A小鼠顯著抑制了SCLC的發展。在兩個模型中，PKA-Cα的表達相似，但在PrkacaM120A小鼠中，PKA活性降低了約50％。因此，在此小鼠模型中，PKA-Cα活性降低一半足以有效抑制SCLC的發育。敲低PKA-Cα可導致25種人類SCLC細胞系生長下降，NCI-H526細胞中PKA-Cα的敲低導致小鼠細胞凋亡的增加和腫瘤生長的顯著抑制。

SCLC的增長需要PKA

3. 通路研究

（1）PP2A抵消了PKA在SCLC中的致瘤作用

先前的研究表明，PKA和PP2A（蛋白磷酸酶2A）之間可能存在功能相互作用。作者使用PP2A抑制劑（PP2Ai）處理可抑制PP2A活性，並增強SCLC細胞中PKA底物的磷酸化，而PKA抑制劑（PKAi）預處理可逆轉這一過程；使用PP2A激活劑（SMAP）處理可抑制PKA底物的磷酸化，並誘導SCLC細胞凋亡。該結果說明PP2A抵消了PKA在SCLC中的致瘤作用。因此，抑制PKA本身或操縱PKA信號網絡中的其他酶可能在SCLC中具有抗癌作用。

PP2A使PKA底物去磷酸化並抑制SCLC的生

（2）GNAS在人類SCLC中被激活，並在小鼠模型中促進PKA活性和SCLC生長

作者發現，由GNAS編碼的Gαs是人類SCLC中表達最高的G蛋白α亞基（GNAS）。Gαs通過激活腺苷酸環化酶（AC）介導G蛋白偶聯受體（GPCR）信號傳導，導致PKA的下遊激活。進一步實驗表明，發生在SCLC患者中的GNAS的擴增和激活突變可以顯著增強小鼠模型中的SCLC進展，從而將Gαs定義為SCLC中的致癌基因。

Gαs是SCLC生長的充要條件

4. 互作組：構建SCLC細胞中PKA信號網絡

利用質譜分析構建了SCLC細胞中的PKA互作組，確定了128個候選相互作用因子，編輯了一個高可信度的蛋白質-蛋白質互作網絡，進一步將PKA置於SCLC細胞中GPCR/Gαs信號網絡的下遊，並將PKA信號與原發性人SCLC腫瘤中的其他遺傳改變聯繫起來。

SCLC細胞中的PKA相互作用信號網絡圖

5. 磷酸化蛋白組：確定下遊信號網絡和PKA直接底物

為了進一步了解SCLC細胞中PKA激活的下遊後果，在NCI-H526細胞（高度依賴於PKA活性）和NCI-H69細胞（具有相對較高的PKA）中進行了磷酸化蛋白質組分析。用cAMP的長效類似物（8-Br-cAMP）激活PKA後，鑑定到上千個磷酸化位點發生了變化，GO分析顯示，與細胞增殖和癌症有關的多種途徑富集。使用磷酸化蛋白質組學方法鑑定了54種PKA底物，敲低其中一些高可信度靶標（包括核糖體亞基RPL34、RPS3A、RPS6）會降低DepMap數據集中人SCLC細胞系的生長。該方法確定了PKA的大量底物，表明PKA激活通過調節多個信號網絡來促進SCLC的生長。

PKA控制SCLC細胞中的大量下遊過程

6. 功能驗證：PKA活性促進SCLC中的癌症幹細胞狀態

在PKA活性較低的NJH29細胞中過表達aPKA（活性PKA）後構建PDX模型，發現aPKA顯著促進腫瘤的生長。進一步對這些PDX模型腫瘤進行了RNA-seq，對表達aPKA的腫瘤中上調基因的分析揭示了與神經元和神經內分泌特徵相關的途徑，許多SCLC幹細胞的標誌物顯著上調。將稀釋的NJH29-GFP和NJH29-aPKA細胞移植到NSG小鼠中進行了極限稀釋分析，結果發現PKA的激活足以增強SCLC幹細胞的頻率。相反，依賴於PKA活性的NCI-H526細胞中PKA-Cα的敲低降低了癌症幹細胞標誌物的表達和腫瘤幹細胞的頻率。因此，SCLC細胞中PKA活性的改變導致信號網絡的變化，該信號網絡調控著控制癌症幹細胞狀態的基因表達程序。

PKA活性促進SCLC幹細胞的擴增

小編小結

本研究利用激酶組分析確定PKA為SCLC中的活性激酶，利用磷酸化蛋白質組學分析確定了許多PKA底物和作用機理，繪製磷酸化蛋白質組如何響應PKA激活而變化的圖譜，並確定PKA激活如何改變SCLC的生物學特性。這些數據提供了探索PKA信號的最大、種類最全的蛋白質組學數據之一，對於深入研究SCLC驅動進程以及其他PKA依賴性和GPCR激活的神經內分泌癌的機制具有重要意義。

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