分子克隆的常用載體

分子克隆的常用載體

來源：來源網絡 2006-12-27 22:54

DNA片段的克隆需要合適的載體，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主複製，即必須具備複製原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在複製原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便於獲得陽隆克隆，載體上常有篩選標記，如對抗菌素的抗性，某些基因產物的顯色反應等。

一、質粒
常用的有pBR322，pUC系列質粒等。
（一）pBR322質粒是4362bp的環狀雙鏈DNA載體，有2個抗藥性基因（四環素和氨苄青黴素），一個複製起始點和多個用於克隆的限制酶切點。當缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉化時，它便從該質粒獲得了抗生素抗性。兩個抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點。一般只選一個抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入後該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉化細菌後篩選陽性克隆之用。

（二）pUC系列質粒是2.7Kb的雙鏈DNA質粒，有一個複製起點，一個氨苄青黴素抗性基因和一個多克隆位點，多克隆位點處於表達LacZ基因產物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC質粒轉化LacZ基因有突變的大腸桿菌株（M15）時，因為由質粒表達的α－肽補充了大腸桿菌卻失的α－肽，所以恢復了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養基上，長出藍色克隆。如果在多克隆位點內插入外源DNA，由於它破壞了α－肽的表達，因而在加入IPTG和X－gal的培養基，不能長出藍色克隆，這就是所謂的藍白篩選。

二、單鏈絲狀噬菌體和噬粒

（一）大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等，其基因組均是單鏈閉環DNA分子，其中M13mp系列克隆載體是對野生型M13加以改造，插入了多克隆位點和LacZ基因後的載體，所以也是可以利用IPTG和X-gal作藍白篩選的，M13感染大腸桿菌後，即在菌體內酶的作用下，以感染性單鏈DNA（正鏈）為模板，轉變為雙鏈DNA，稱作複製型DNA（RF DNA）。一般當每一個細胞內有100-200個RF DNA拷貝時，即停止複製，產生有感染性的完整的單鏈絲狀噬菌體並分泌離開菌體。感染M13的大腸桿菌可繼續生長，並不發生裂解，但生長速度則較正常菌慢，取感染M13的細菌培養液離心，即可從菌體中提取RF DNA，供限制酶切割等分子克隆操作之用；從離心後的上清液中，可用聚乙二醇（PEG）沉出噬菌體顆粒，提取單鏈DNA（ss DNA）供DNA序列分析，體外定位突變等使用。

（二）噬粒（phagemid）在質粒DNA中插入一段單鏈噬菌體的複製起始點DNA，即構成了噬粒，如pGEM-3Zf（-）就是一種噬粒。噬粒可像一般質粒一樣操作，但當需要製備單鏈DNA時，就需要在培養時加入輔助噬菌體，常用的輔助噬菌體有M13KO7和R408。培養好的菌液在離心除去菌體後，上清中加入PEG即可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也常用於DNA序列分析和體外定位突變。分子克隆常用載體除了上述兩類以外，還有 噬菌體和粘粒，詳細情況可參閱有關資料。

本網站所有註明「來源：生物谷」或「來源：bioon」的文字、圖片和音視頻資料，版權均屬於生物谷網站所有。非經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任。取得書面授權轉載時，須註明「來源：生物谷」。其它來源的文章系轉載文章，本網所有轉載文章系出於傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與

我們聯繫

，我們將立即進行刪除處理。

溫馨提示：87%用戶都在

生物谷APP

上閱讀，掃描立刻下載! 天天精彩！