載體表達的siRNA分子對豬圓環病毒2型複製的抑制作用

2020-12-01 生物谷

微生物學報 Acta Microbiologica Sinica

48(11)：1507~1513; 4 November 2008

ISSN 0001-6209; CN11-1995/Q

載體表達的siRNA分子對豬圓環病毒2型複製的抑制作用

王海燕，劉文博，高崧*，劉秀梵

(揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室，揚州 225009)

摘要：【目的】尋找一種基於RNA幹擾技術的豬圓環病毒2型感染的防控方法。【方法】根據豬圓環病毒2型毒株基因組核苷酸序列，設計了3條特異性小幹擾RNA（short interfering RNA，siRNA）分子，其中2條針對豬圓環病毒1型和2型複製酶基因（rep），1條針對豬圓環病毒2型核衣殼蛋白基因(cap)，將合成的DNA片段退火形成雙鏈，分別連接到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen 載體鼠源U6啟動子下遊，轉化大腸桿菌得到陽性克隆，測序鑑定後分別命名為Retro-SH1，Retro-SH4，Retro-SH6。用上述質粒轉染PCV2感染前、後的Dulac細胞及肌肉注射PCV2感染前、後的BALB/c小鼠，應用實時定量PCR試驗評價其對病毒在細胞及小鼠體內複製的抑制作用，免疫組化法檢測脾臟中病毒的存在。【結果】感染PCV2前或後轉染500 ng Retro-SH1，Retro-SH4，Retro-SH6質粒能有效抑制PCV2在Dulac細胞上的複製，抑制率最高可達99%以上，對10株不同來源的臨床分離株在細胞中複製的抑制作用同樣明顯，且不同毒株間差異不大。動物試驗中，肌肉注射10  g上述不同siRNA分子對小鼠體內PCV2的複製有一定的抑制作用，其抑制率在26%至99%之間。【結論】載體表達的siRNA分子可能成為防控豬圓環病毒2型感染的一種新工具。

關鍵詞：RNA幹擾；豬圓環病毒2型；複製；抑制

中圖分類號：R392    文獻標識碼：A   文章編號：0001-6209 (2008) 11-1507-07

Inhibition of porcine circovirus type 2 replication by the plasmid vector expressing siRNAs

Haiyan Wang, Wenbo Liu, Song Gao*, Xiufan Liu

(Key Laboratory of Animal Infectious Diseases of Ministry of Agriculture, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

Abstract: [Objective] To develop siRNA as a potential tool for control of porcine circovirus 2 (PCV2) infection. [Methods] We designed two short interfering RNAs (siRNAs) related to the replicase (rep) gene of porcine circovirus and one related to capsid (cap) gene of PCV2 basd on the genomic sequences of the viruses deposited in GenBank. The corresponding DNA fragments were synthesized, annealed and ligated into the downstream of the mouse originated U6 promoter of the RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen vector. As controls, the siRNAs specific to Luciferase contained in the vector kit and negative fragments with no similarities to any known species were also included. We transformed the recombinant plasmids into the host bacterium DH5α and positive clones were selected. The positive clones were sequenced and five clones carried the correct inserts. They were designated as Retro-SH1，Retro-SH4，Retro-SH6，Retro-Luc and Retro-NC. To test whether the siRNAs specific to PCV expressed by the vector could inhibit the virus replication, we evaluated the inhibition effect on PCV2 replication both in Dulac cells and experimental mice using real-time PCR and immunohistochemistry. [Results] The results showed that the purified plasmids could strongly inhibit the replication of the PCV2 virus and the inhibition rate reached to 99% in cell culture. In the animal experiments, siRNAs expressed by the plasmids could inhibit the replication of the PCV2 virus and the inhibition rate varied from 26% to 99%. [Conclusion] The siRNAs specific to PCV2 expressed by vectors should be potential in the control of the diseases related to PCV2 infection.

Keywords: RNA interference; porcine circovirus type 2; replication; inhibition

生物谷推薦全文下載：載體表達的siRNA分子對豬圓環病毒2型複製的抑制作用

更多全文請查看連結：http://journals.im.ac.cn

聲明：本文由《微生物學報》授權生物谷 www.bioon.com 網站發布，如需轉載請直接與中國科學院微生物研究所期刊聯合編輯部聯繫並支付相應費用，未經授權不得轉載，若轉載將付相應的法律責任

相關焦點

  • 一例豬圓環病毒 2 型與豬球蟲病混合感染的診治案例
    豬圓環病毒( PCV) 在國內很多豬場均有流行，主要是由豬圓環病毒 2 型感染引起，包括豬斷奶後多系統衰竭症候群、豬皮炎－腎病症候群、繁殖障礙、肺炎等，是目前嚴重威脅生豬健康的疫病，給養豬產業造成巨大的經濟損失豬球蟲病是由寄生在腸道內的艾美科球蟲導致的腹瀉、腸炎等症狀。
  • 應用病毒載體抑制癌細胞轉移研究綜述
    國際著名學術期刊《先進藥物遞送綜述》（Advanced Drug Delivery Reviews）在7月最新一期上發表了中科院上海巴斯德研究所研究員周東明有關基因治療中應用病毒載體抑制癌細胞轉移的研究綜述
  • shRNA和siRNA
    前者在核內，後者在細胞質，我的理解是發揮作用最後都是在細胞質，shRNA在細胞內會自動被加工成siRNA，使靶基因沉默，且比siRNA 作用更穩定、高效。。兩者都是通過基因沉默抑制蛋白表達的工具圖 1. siRNA和shRNA結構。（A） siRNAs是短的RNA雙鏈，在3『端有兩個鹼基的游離。
  • B肝藥物開發RNAi激活劑,抑制基因表達,臨床前研究艱辛道路
    B肝藥物開發RNAi激活劑，抑制基因表達，臨床前研究艱辛道路研究表明，使用這種方法可以抑制HBV基因表達。然而，在哺乳動物細胞中誘導RNAi的最初嘗試以失敗告終。研究人員解釋，因為長雙鏈RNA誘導幹擾素反應，導致非特異性基因沉默和凋亡。
  • 分子克隆的常用載體
    ，載體或是質粒，或是噬菌體，或是病毒，通常大多經過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件：一是該載體在細胞內必須能自主複製，即必須具備複製原點；二是該載體必須具備適合的酶切位點，且這些酶切位點不在複製原點區域內。以上兩條，保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便於獲得陽隆克隆，載體上常有篩選標記，如對抗菌素的抗性，某些基因產物的顯色反應等。一、質粒常用的有pBR322，pUC系列質粒等。
  • 豬圓環病毒不同基因型在環境中存在不同，跟免疫有關嗎？
    受圓環病毒影響的動物當研究歐洲、亞洲、北美等地豬圓環病毒病的大規模暴發時，發現在所有分析這些健康問題的國家，從2001年到2004年左右，基因型a向基因型b的流行率發生了非常明顯的變化。基因型a的嚴重問題發生的頻率遠低於基因型b。而顯而易見的問題是，為什麼這些基因型的頻率會發生變化？
  • B肝RNAi新藥方向,依賴非病毒傳遞,而非應用病毒載體
    B肝RNAi新藥方向，依賴非病毒傳遞，而非應用病毒載體RNAi幹擾的未來方向，已經越來越明晰。例如，表達抗-HCV-shRNAs的組合慢病毒載體，已被使用於抑制C肝病毒（HCV）複製。當然，在RNAi臨床前的動物模型研究中，其作為抗病毒藥物潛力，也有相關文獻期刊作證。
  • 【分子克隆專題】第十一期:慢病毒載體
    慢病毒的產生和轉導如上圖步驟｜，用包膜、轉移和包裝載體轉染慢病毒包裝細胞系。包膜、轉移和包裝載體轉錄的mRNA分別被翻譯成：通過內質網進入細胞膜的病毒包膜蛋白（2a）；單鏈RNA病毒基因組（2b）；病毒結構蛋白和酶（2c），這三種成分組裝成病毒顆粒，從宿主細胞膜上出芽。
  • B肝在研新藥2項發現,鴨動物模型,降低肝腺病毒複製能力
    這項研究發現是由加彭利伯維爾醫學院細胞和分子遺傳學生物學系等研究人員發表在2020年12月21日的Pharmaceuticals上。B肝在研新藥2項發現，鴨動物模型，降低肝腺病毒複製能力Pharmaceuticals，是一個藥物化學和相關藥物科學的開放存取期刊（見下圖）。
  • 研究開發出長效抑制miRNA病毒載體
    麻薩諸塞大學醫學院的研究人員將腺相關病毒（AAV）載體與miRNA誘餌（tough decoys）相結合，實現了小鼠中miRNA功能的長期、高效抑制。
  • siRNA質粒載體構建
    siRNA 質粒載體的構建RNA 小片段可以通過化學合成或質粒載體轉錄獲得。質粒載體的構建是將長約70bp的含有特定莖環以及終止信號的DNA分子插入到特定載體中，該DNA分子可以 在細胞中轉錄為含有特定髮夾結構的RNA雙鏈分子。這些髮夾RNA分子在細胞中被切割為19-23nt的雙鏈RNA小片段，從而起到抑制特定基因表達的作用。
  • 通過臨床試驗證實:金銀花可抑制新冠病毒複製,加速患者好轉!
    該研究發現金銀花中的MIR2911可以被小鼠吸收，並直接靶向甲流病毒，從而抑制病毒複製。　MIR2911在金銀花湯劑中能夠穩定存在，經口服後能被吸收進循環，並遞送到各個組織中去。經檢測，給小鼠餵食0.5ml金銀花湯後，小鼠肺組織中平均每個細胞含有1600個MIR2911分子，已完全具有生物學功能。進入肺上皮細胞中的MIR2911可以直接與各種流感病毒的mRNA結合，直接抑制病毒的複製。
  • 鍾南山團隊:連花清瘟有抑制新冠病毒細胞複製的作用
    記者23日獲悉，國外期刊《藥理學研究》(Pharmacological Research，IF 5.572)近日在線刊出名為《連花清瘟對新型冠狀病毒具有抗病毒、抗炎作用》的研究文章，論文作者包括廣州醫科大學呼吸疾病國家重點實驗室主任鍾南山、研究員楊子峰等。
  • ...Ad5-nCoV採用基因工程方法構建,以複製缺陷型人5型腺病毒為載體...
    2020-04-09 19:25:35來源：FX168 【全球首個新冠疫苗近期將啟動II期臨床】康希諾公司發布公告指出，根據重組新型冠狀病毒疫苗（腺病毒載體
  • B肝在研新藥2項發現和抑制特異性HBV基因
    這項研究發現是由加彭利伯維爾醫學院細胞和分子遺傳學生物學系等研究人員發表在2020年12月21日的Pharmaceuticals上。B肝在研新藥2項發現，鴨動物模型，降低肝腺病毒複製能力Pharmaceuticals，是一個藥物化學和相關藥物科學的開放存取期刊（見下圖）。
  • 新型冠狀病毒肺炎(COVID19)防治:抑制病毒複製為基礎,阻止CICS進程
    特別是一些感染的醫生，還有重症及危重症，這些與SARS-CoV-2（2019nCoV）病毒分子生物學及複製等遺傳學機制，及其感染後相關系統性反應有關。病毒複製刺激固有免疫，激活補體、單核巨噬細胞、淋巴細胞及其亞群等，參與炎症網絡因子激活和放大。補體系統形成的膜攻擊複合物，或淋巴細胞介導的細胞毒性作用造成靶細胞膜損傷，導致細胞免疫溶解，從而進一步加劇炎症反應。
  • 如何做好慢病毒載體實驗?跟著我試一下
    慢病毒載體含有順式作用元件 - 中央多聚嘌呤區（central polypurine tract，cPPT）使其不受細胞分裂的控制，允許廣泛細胞類型的有效轉導，包括靜止細胞；且因其整合位點更安全，轉基因負荷量更大（可容納 6.5 kb 外源基因）及基因毒性更小等優勢，在臨床試驗中，慢病毒載體比其他基因轉導方法更常用。
  • 泛素化及去泛素化在病毒感染中的作用
    病毒感染細胞後，RIG-I識別病毒複製產生的dsRNA後發生寡聚化，通過自身的CARD區域與IPS-1的CARD區域結合，活化IPS-1,從而招募TBK1等信號分子，引起IRF3磷酸化以及二聚化，最終阻止其入核從而抑制I型幹擾,素的表達。
  • 加州理工團隊揭示新冠病毒抑制宿主防禦的機制
    我們尚未完全了解SARS-CoV-2病毒感染在人體細胞中發病機制的分子基礎。因此，迫切需要理解這些機制，以指導治療。SARS-CoV-2編碼27種蛋白質，在病毒複製和組裝中具有不同的功能（Bar-On et al., 2020; Wang et al., 2020）。
  • B肝新藥早期發現,PNAs/siRNA結合,可成未來開發工具
    有意思的是，膽固醇siRNA結合物可以到達特定組織，並抑制基因表達。而其他基於脂質的系統，已被應用於慢性B肝病毒治療，與未偶聯的siRNA分子相比，siRNA活性大大增加，這就是研究人員發現的脂質寡核苷酸結合物。研究人員還發現聚合物寡核苷酸偶聯物，聚合物也是作為細胞內，攝取寡核苷酸策略的分子之一。此外，它還被用作載體的聚合物保護不受到核酸酶的降解影響。