磷酸化位點置信度分析

2021-02-28 康昱盛

近期，利物浦大學的蛋白質研究中心和生物化學部，做了一系列工作，從質譜方法和分析軟體這兩個方面對磷酸化位點置信度的分析進行了討論。毫無疑問，提高磷酸化肽段的鑑定效率最有效的採用高分辨的串聯質譜。另外，磷酸化肽的可信度和位點的鑑定可以通過增加二級碎片離子的數量來提高，所以採用多種互補的碎裂模式可以實現這一點。

作者對U2OS T-Rex Flp-in細胞抽提的蛋白酶解產物，通過TiO2富集得到磷酸化肽段，同時加入合成的標準磷酸化肽段，以確保磷酸化位點置信度，採用反相毛細管HPLC分離聯用Orbitrap TM FusionTM  Tribrid質譜分析。在質譜採集數據時，採用DDA模式，MS1都採用Orbitrap，多種碎裂模式和其分別設置的解析度見下圖。在ETcaD/EThcD模式，所有母離子碎裂為碎片離子時都設置了中性丟失97.9763和80 Da，在質量容差上Orbitrap的數據設置了20ppm，離子阱的數據設置0.5 m/z，中性丟失離子即為MS2離子信號強度前十之一。

作者採用的數據分析平臺是Thermo Proteome Discoverer (v. 1.4)內置Mascot 2.6搜尋引擎，和整合了Andromeda的MaxQuant（1.5.8.0）。參數：MS1 tolerance 10 ppm；Orbitrap檢測的MS2 mass tolerance設置為0.01Da，ion trap的設置為0.6 Da。資料庫為包含了合成標準化磷酸化肽段和Uniprot human資料庫，其中標準磷酸化肽段的序列參考以往發表的大規模磷酸化多肽研究文獻中，一共175條（191個磷酸化位點）磷酸化肽段。不同的搜尋引擎均採用了1%的FDR對PSM進行整體數據卡值。

作者將不同的質譜方法、數據分析方法對標準化磷酸化多肽鑑定和位點鑑定的結果，以及細胞樣本的磷酸化多肽和位點的分析的結果分別做了比較。

我們發現Mascot在鑑定得到的PSM和unique 磷酸化肽段的數目都高於Andromeda的鑑定數，在設置了中性丟失的搜庫方法得到的磷酸化位點的數量都有更好的表現，同時作者通過合成的標準化磷酸化多肽確定磷酸化位點的false localization rate（FLR）。在人細胞樣品的磷酸化多肽分析中，引入了1%FLR的篩選，Mascot/ptmRS的組合在磷酸化肽段和磷酸化位點的鑑定中得到了更好的結果，在所有高分辨的質量分析器得到的數據中，小於1%FLR的磷酸化位點的數目較MaxQuant的組合而言明顯增多。

從質譜數據採集方法上比較，最好的磷酸化位點置信度是在EThcD碎裂模式在Orbitrap的MS平臺產生的，而從unique 磷酸化肽段的總數和磷酸化置信位點數目上和而言，則是在HCD碎裂模式下的高分辨二級質譜質量分析器得到的。所以最終作者的數據表明他們在選用HCD碎裂模式，MS1和MS2均採用Orbitrap，Mascot/ptmRS的數據分析組合作為最佳的磷酸化蛋白組分析方案。另外，作者還對磷酸化多肽的價態對於位點置信度的影響也做了分析。

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