10.先傾倒上清,然後通過一個寬口移液管輕輕吸出,去掉儘可能多的上清。
11.加入20mL冰冷的CCMB80緩衝液,並旋動離心瓶中的混合物,輕柔地重懸細胞。當沉澱懸浮好後,再次添加60mL冰冷的CCMB80緩衝液並旋動。如果懸液中依然有塊狀的細胞,非常輕柔地上下吹打將小塊分散開。然後,懸液在冰上孵育20min。
12.將懸液4C離心10min,讀取600m處的OD值。
13.如前所述去除上清(步驟10),用10mL冰冷的CCMB80緩衝液重懸沉澱。
14.將200uL SOB加入到塑料管中。添加50μL大腸桿菌懸液,輕輕混勻,避免產生氣泡。
15.計算所需要的CCMB80緩衝液的量,以將剩餘細菌懸液的OD值調整到1.0~1.5。加入所需冰冷的CCMB80的量到懸液中。
16.在冰上孵育稀釋後的懸液20min。
17.按每管50μL分裝到預冷的2mL螺旋蓋冷凍管中。如前所述冷凍懸液(步驟5)。
18.用如下介紹的方法測定細胞的感受態活性。測定感受態活性轉化效率用於定量化學處理製備的細菌感受態的活性,通常表示為每微克標準製備的質粒DNA (如pUC19)得到的轉化體數量。要準確地測定轉化效率,必須避免使用飽和量的測試質粒。
通常情況下,約10ng標準製備的質粒DNA能使一份50μL化學感受態細菌的轉化能力飽和。因此,應使用非飽和量的DNA ( 10~ 50pg質粒DNA)來測定轉化效率。