CRISPR基因編輯MC-3T3細胞系——骨相關研究的神器

1981年, 科學家成功從新生小鼠頭蓋骨中獲得了成骨細胞模型--MC-3T3細胞。這種成骨細胞系在體外保持了向成骨細胞分化和礦化的能力，使其成為骨生物學研究中非常有用的細胞模型。MC-3T3能夠產生膠原並分化為成骨樣細胞，在體外和體內形成鈣化組織。早期的研究表明，骨組織通過成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收不斷重塑，以維持骨體積和體內平衡。因此，骨重建被認為是由成骨細胞、破骨細胞和骨細胞之間的串擾來調節的。MC-3T3細胞也成為了此類骨相關研究的重要體外模型。

應用：

MC-3T3細胞具有向成骨細胞分化的能力。基於CRISPR/Cas9的MC-3T3細胞基因編輯可以加速骨研究。MC-3T3已經廣泛應用於以下幾類研究：

1. 型膠原蛋白生物合成，這是細胞外骨基質中最重要和最豐富的有機成分，提供骨骼強度和柔韌性。

2. WNT信號通過調節成骨細胞增殖分化和基質礦化而成為骨形成的重要調節因子。

3. 轉化生長因子TGFβ信號轉導，骨重建異常，骨轉換增加。

4. 成骨細胞分化，一種調控成骨細胞分化的成骨細胞特異性轉錄因子。功能喪失導致成骨細胞分化和骨形成減少。

CRISPR-U™ 介導的MC-3T3細胞的基因編輯

基因編輯和細胞模型的建立可以促進功能基因組學、信號通路、代謝、細胞死亡、藥物發現、藥物反應和癌症等領域的研究。目前，成骨細胞模型（MC-3T3）廣泛應用於細胞分化、旁分泌因子對骨形成或吸收的影響研究。最近的研究發現，影響骨組織穩態的突變蛋白和新的途徑參與骨骼發育和維持。為了加速骨生物學研究，利用CRISPR/Cas9系統可以在MC-3T3細胞中實現基因組編輯。CRISPR-U™是源井生物獨立研發的，可用於MC-3T3細胞快速精確基因編輯的系統。通過CRISPR構建的細胞模型使研究各種骨骼疾病的機製成為可能，這些疾病主要與骨骼發育、吸收、骨肉瘤和代謝過程有關。在闡明致病機制的基礎上，這些細胞模型可以與藥物篩選和其他治療研究相結合。

案例分析

利用CRISPR介導的基因敲除MC-3T3，發現一種預防或逆轉骨質疏鬆症的新途徑:

骨質疏鬆症是一個巨大且日益嚴重的公共健康問題。骨質疏鬆症以低骨量和骨微結構缺陷為特徵，導致骨折的易感性增加。骨骼健康的維持有賴於骨吸收的破骨細胞和成骨細胞的協調和平衡作用，從而實現骨骼的淨平衡。因此，臨床上需要尋找新的治療骨質疏鬆症的分子靶點，特別是那些在刺激骨形成的同時抑制骨吸收的分子靶點。維甲酸受體相關孤兒受體β（Rorβ）是一種新的成骨細胞分化的負調節因子，在從老年骨質疏鬆小鼠分離的骨髓源性骨祖細胞中Rorβ的表達高度升高，提示Rorβ在介導年齡相關性骨丟失中的潛在作用。在成骨前小鼠細胞系MC-3T3中的過度表達研究表明，已知的成骨途徑有顯著的調節作用，支持Rorβ調節成骨的關鍵作用。研究人員應用CRISPR/Cas9基因編輯技術證明，成骨細胞中Rorβ的丟失增強了Wnt信號傳導，特別是通過在Wnt靶基因Tcf7和Opg的啟動子中增加β-catenin對T細胞因子/淋巴增強因子（Tcf/Lef）DNA結合位點的招募。因此，通過增加Rorβ缺陷MC-3T3細胞中骨保護素（OPG）的分泌，增加成骨基因的表達並抑制破骨細胞的形成。

CRISPR介導的Rorβ突變體的構建及基因表達分析：

Rorβ基因有兩個亞型（Rorβ1和Rorβ2），其中Rorβ2亞型不可檢測。因此，Rorβ1是Rorβ基因的代表。Rorβ1的ATG起始密碼子位於外顯子1的3′端，因此，靶向外顯子2進行基因編輯。設計3個gRNA，在測試編輯效率後，選擇一個gRNA刪除MC-3T3細胞中的Rorβ。用非特異性gRNA產生的對照細胞系MC3T3-Cont。mc3t3drorβ細胞系的克隆和序列分析顯示，小鼠Rorβ等位基因存在1鹼基對（bp）和4-bp缺失，導致移碼突變，最終導致無功能等位基因。為了分析Rorβ缺失對成骨細胞基因表達的影響，從成骨培養基中培養的MC3T3-Cont和MC3T3-DRorβ細胞中採集不同時間點的RNA樣本。QPCR分析顯示骨標記基因在MC3T3-DRorβ細胞中的表達顯著增加。

圖1:CRISPR/Cas9在MC3T3-E1前成骨細胞中Rorβ缺失。（A）顯示了小鼠Rorβ基因的內含子/外顯子結構。（B）用CRISPR/Cas9基因編輯方法對小鼠Rorβ基因第2外顯子（大寫）進行了突變。用於靶向等位基因的gRNA序列以黃色突出顯示。（C-G）兩種細胞模型用成骨培養基處理，並在第0-10天（n=6）採集供骨標誌物進行qPCR。Rorβ缺陷成骨細胞通過β-catenin依賴機制顯示增強的Wnt信號：

突變的MC3T3-DRorβ細胞被用來識別典型細胞通路的改變。他們觀察到Wnt/β-catenin通路的顯著改變，以及MC3T3-DRorβ細胞中調節該通路的幾種已知的調節因子的表達。IPA分析顯示T細胞因子/淋巴增強因子（Tcf/Lef）DNA結合位點顯著富集。這些結果表明，成骨細胞中Rorβ的丟失導致Wnt/β-catenin通路的改變。RNAseq證實了兩個著名的Wnt靶基因Opg和Tcf7，並觀察到該基因在Rorβ缺陷細胞中的表達在整個時間過程中顯著上調。Wnt通路在Rorβ缺陷成骨細胞Opg和Tcf7上調中的作用，使用DKK1或JW55進行的一系列抑制劑研究發現Wnt通路因Rorβ的丟失而改變。

圖2:Rorβ調節Wnt/βcatenin通路。（A，B）RNAseq和IPA分析鑑定的Wnt/βcatenin調控基因在MC3T3 DRorβ中有顯著調控。（C，D）重新查詢和分析圖1中的時間進程，以獲得Opg和Tcf表達式。（E，F）MC3T3-Cont和MC3T3-D Rorβ細胞系在合流處用成骨培養基處理，然後補充Dkk1（200ng/mL）、JW55（10mM）或兩者兼用；48小時後取細胞，並對Opg和Tcf7進行qPCR（n=6）。

Rorβ缺陷細胞通過產生OPG抑制破骨細胞的形成:

對MC3T3-Cont和MC3T3-DRorβ細胞進行晶片檢測，以了解β-catenin調控Opg和Tcf7基因的機制。研究人員發現，在Rorβ缺陷細胞中，位於Opg和Tcf7基因啟動子內的Tcf/Lef DNA結合位點的β-catenin和RNA聚合酶（RNAP）募集增加。他們驗證了Rorβ抑制了TOP-FLASH Wnt報告結構中組成活性形式β-catenin（ca-βcat）的轉錄活性。因此，他們得出結論，Rorβ通過抑制成骨細胞Wnt反應基因啟動子中Tcf/Lef結合位點的β-catenin募集來抑制Wnt活性。他們評估了OPG增加對破骨細胞生成的影響。他們發現Rorβ缺陷細胞能夠通過增加OPG的產生和分泌來抑制破骨細胞的生成。

圖3:Rorβ-缺失增強了β-catenin向Wnt反應基因啟動子的募集。（A–D）在用10 ng/mL Wnt3a或未經處理（基礎）6小時後，對MC3T3 Cont和MC3T3 DRorβ細胞系進行晶片分析。對Opg和Tcf7基因啟動子中的β-catenin、RNAP和QPCR進行IPs檢測。這些數據是與IgG陰性對照IP相關的。（E）Ca-βcat和TOP-FLASH共轉染-/+Rorβ，48小時後測定螢光素酶活性（n=6）。（F）收集處理細胞的CM，ELISA法測定OPG蛋白水平。（G）骨髓源性破骨細胞前體與含1%培養基的破骨細胞支持培養基孵育。

綜上，Rorβ缺失對骨保護作用在骨微環境中引發多方面的反應。Rorβ的缺失通過增加Tcf7和Wnt信號反應來促進骨形成。同時，Rorβ缺失通過增加OPG的產生和分泌來影響骨吸收，從而減少破骨細胞數量和破骨細胞活性。總的來說，增加骨形成和減少骨吸收是預防骨丟失的結果。抑制Rorβ可能是防治骨質疏鬆症的新途徑。

CRISPR-U™ 高效修飾MC-3T3細胞系基因

CRISPR-U™ 是源井生物自主研發的細胞系基因編輯技術。通過對基因編輯載體和過程的優化，提高了CRISPR-U基因切割、重組的效率，是傳統基因編輯的十倍。我們可以根據您的需求定製基因編輯MC-3T3細胞系，滿足基因編輯的各種需求。為您提供基於敲除、敲除和點突變的MC-3T3模型細胞，助力骨生物學相關的研究。

References:

1. Osteoprotection Through the Deletion of the Transcription Factor Rorb in Mice. Journal of Bone and Mineral Research, 33(4) 2018, 720–731.

註明 | 文章是源井生物原創，轉載請註明。

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