2020年12月11日訊/
生物谷BIOON/---在一項新的研究中，來自俄羅斯科學院、俄羅斯國家研究中心分子遺傳學研究所和斯科爾科沃科學技術研究院等研究機構的研究人員描述了兩種新的緊湊的Cas9核酸酶，即CRISPR-Cas系統具有切割活性的組分，這將有可能擴大Cas9工具箱在基因組編輯中的應用。這兩種Cas9核酸酶中的一種被證實可以在人類細胞中發揮作用，因而可用於生物醫學應用。相關研究結果發表在2020年12月2日的Nucleic Acids Research期刊上，論文標題為「PpCas9 from Pasteurella pneumotropica — a compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells」。論文通訊作者為俄羅斯國家研究中心分子
遺傳學研究所的Konstantin Severinov博士。
圖片來自Nucleic Acids Research, 2020, doi:10.1093/nar/gkaa998。
CRISPR-Cas是借用
細菌的基因組編輯技術，它依賴於Cas核酸酶；這些酶在CRISPR RNA的引導下，可以降解目標基因序列---它們是「基因剪刀」中的刀片。在研究應用中，最受歡迎的Cas9核酸酶是釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9，即II-A型SpCas9。它的效率很高，而且相對簡單，這是因為一個較大的蛋白既能結合crRNA，又能切割DNA；它還需要一個短的PAM序列---一串位於在靶位點兩端的核苷酸，以便SpCas9用來定位和「讀取」它。
但是SpCas9是一個較大的蛋白，當人們想使用腺相關病毒（AAV）顆粒作為
載體將這種「基因剪刀」遞送到細胞中時，這就會產生問題。理想情況下，人們希望將編碼這種Cas蛋白的基因和嚮導RNA（gRNA）序列都裝入一種病毒顆粒中，而這種尺寸限制需要較短的Cas9種類。然而，那些較短的核酸酶往往需要更長、更複雜的PAM，因此科學家們面臨著蛋白大小和靶標選擇之間的權衡。
在這篇論文中，最近通過斯科爾科沃科學技術研究院博士答辯的Iana Fedorova以及Severinov實驗室研究員Aleksandra Vasileva及其同事們描述了兩種新的小型Cas9核酸酶：一種來自Defluviimonas sp.20V17（一種生活在熱液噴口的細菌），即DfCas9，另一種來自侵肺巴斯德菌（Pasteurella pneumotropica，一種在齧齒動物和其他哺乳動物中發現的常見
細菌），即PpCas9。這兩種核酸酶恰好對AAV
載體來說足夠小，並且具有相對較短的PAM，對於Cas9核酸酶來說，這是「兩全其美」的選擇。
這兩種新的Cas9核酸酶與II-C型CRISPR-Cas系統有關，與SpCas9相比，通常表現為更小的Cas9效應物。這兩種核酸酶採用了類似於其他Cas9蛋白的保守的雙葉結構，但也有獨特的特點：它們缺乏幾個插入子結構域，並且有一個較小的Wedge結構域（負責與單向導RNA支架相互作用的結構域，因而更加緊湊。
Fedorova說，「事實上，II-C型Cas9效應物往往需要較長的PAM序列，但這只是基於迄今描述的有限數量的II-C型Cas9效應物的觀察。例如，最近發現的來自耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）的Cas9（SauriCas9），與PpCas9類似，需要短的PAM（5'-NNGG-3'）。很可能很快就會發現更多需要短PAM的II-C型Cas9酶。這些具有不同PAM要求的小型Cas9蛋白擴大了真核和原核基因組中潛在的可編輯DNA靶點的數量。」
體外研究和在
細菌中的實驗表明，這兩種Cas9核酸酶能高效地切割DNA，而且PpCas9核酸酶在人體細胞中也很活躍。這些結果也發現它們與其他已被證明在真核細胞中起作用的Cas9核酸酶-- Nme1Cas9和Nme2Cas9---非常相似。雖然還需要開展更多的研究來確定這兩種Cas9核酸酶的效率，但是這些研究人員認為它們可能為微生物工程和生物醫學基因組編輯中使用的更傳統的核酸酶提供了一種可行的替代物。
Fedorova指出，對PpCas9脫靶編輯（非預期修飾）的初步研究表明，這種酶具有合理的特異性。但要證實PpCas9的特異性足以被視為一種基因組編輯工具，還需要使用更複雜的方法進行額外的研究。
她補充道，「此外，看起來PpCas9在靶向細胞中的不同基因方面表現出選擇性。這可能會減少PpCas9可能的基因組靶點的範圍，這種偏好性是一個值得進一步研究的課題。」（生物谷 Bioon.com）
參考資料：1.Iana Fedorova et al. PpCas9 from Pasteurella pneumotropica — a compact Type II-C Cas9 ortholog active in human cells. Nucleic Acids Research, 2020, doi:10.1093/nar/gkaa998.