Sens. Actuators B Chem.:利用zeta電位作為信號輸出手段和抗汙型納米平臺實現複雜樣本中核酸分子的定量分析

2021-01-20 分析人

背景介紹：

    核酸傳感方法的開發在生命科學中的諸多領域，如臨床診斷、法醫、基因操作和DNA邏輯系統等，發揮著至關重要的作用。為了應對這些挑戰，研究者們嘗試利用多種信號輸出手段，如凝膠電泳、螢光、比色和電化學等技術平臺，實現核酸的高靈敏分析。然而，以上方法各有優缺點，在實際操作層面上，仍然需要探索更為簡便、低成本和高靈敏度的核酸檢測分析技術。


Zeta電位是一個重要的表面參數，被廣泛用於表徵膠體的穩定性和表面功能化。從理論層面上來看，zeta電位可以很好地反饋溶液中納米顆粒表面電荷的變化，而且目前的電位儀還具有操作簡單、靈敏度高、無侵襲性、無需信號標記等優勢，是一種潛在的定量分析工具。從操作層面上來看，使用zeta電位作為信號輸出方法，可以在均質溶液中可以實現「一步法」檢測生物分子，同時避免了複雜的表面修飾、繁瑣的孵育和洗滌步驟。


然而，目前主要有兩大難題限制了zeta電位在生物定量分析中的應用。第一、生物樣品中存在大量的蛋白質分子等雜質，容易在納米顆粒上形成蛋白質冠，掩蓋靶標物所導致電位信號變化。第二、分散在水溶液中的納米顆粒為了維持其穩定性，通常具有較高的電荷性，zeta電位的變化通常會影響膠體溶液的穩定性，難以對電位強度進行準確檢測。此外，納米材料的高zeta電位強度造成了較高的背景信號，從而降低了檢測的敏感性。因此，利用zeta電位完成生物樣品中分子的定量檢測仍然是一個艱巨的任務。   

   

    近期，合肥工業大學李超博士與安徽醫科大學第二附屬醫院楊育才博士共同報導了一種具有抗汙和可重複利用特性的納米平臺，以zeta電位作為信號輸出手段，實現核酸分子的無標記、高靈敏檢測，相關成果以「Couplingof an antifouling and reusable nanoplatform with catalytic hairpin assembly forhighly sensitive detection of nucleic acids using zeta potential as signalreadout」為題發表在國際化學權威雜誌Sensors and Actuators B: Chemical上（DOI:10.1016/j.snb.2020.128845）。

 

研究的主要內容介紹：

    該論文報導了一種簡單、高靈敏的方法，以zeta電位作為信號輸出手段，完成了對複雜均質溶液中核酸的定量檢測。首先合成一種由磁性納米顆粒(Magnetic nanoparticle，MNP)為核心和兩性脂質（1,2-dioleoyl-sn-glycero -3-phosphatidylcholine，DOPC）為外殼的防汙型納米平臺。該納米平臺具有以下三個功能:1) MNP核心可使完成分子識別後的納米粒子通過簡單的磁分選步驟，對所在溶液進行緩衝液置換，將分析體系中大量的雜質去除，為後續精確測量zeta電位提供良好檢測環境; 2) 兩性脂殼呈電中性，是一種天然的抗汙分子層，同時屏蔽了MNPs自身的電位; 3) 脂質外殼方便了同樣呈電中性的肽核酸（peptide nucleic acid, PNA）的修飾，標記有膽固醇的肽核酸可以由疏水作用直接嵌入脂質分子層中，而且脂殼還可以避免PNA誘導的不可逆粒子聚集。


    利用這一獨特的納米工具，在最優條件下，可定量檢測到溶液中皮摩爾濃度的DNA片段分子，以乳腺癌相關基因BRCA1片段為例，此時最低檢測濃度為3.6pM。同時，聯用非酶信號放大方法，如催化髮夾組裝(CHA)技術，可以進一步提高靈敏度，而且保留良好的序列區分能力，此時可將BRCA1片段的檢測下限降至12.5fM。此外，使用過的納米顆粒，可以通過磁分選和DNA酶降解步驟，被重新回收，進一步降低了檢測成本。

 

    檢測原理：如圖1A所示，將膽固醇修飾的PNAs (Ch-PNA)直接與MNPs@DOPCs孵育，經過簡單的磁分離，去除多餘的PNA鏈，得到穩定的PNA/MNPs@DOPCs。在沒有靶標的情況下，由於DOPC殼層和PNA均呈電中性，zeta電位趨於0mV。在引入帶有大量負電荷的核酸靶標後，它們與PNAs雜交，導致納米顆粒呈負電性。因此，可以簡單通過PNA/MNPs@DOPCs表面電荷變化來確定靶標物的濃度。


    為提高靈敏度，引入了CHA技術。如圖1B所示，目標寡核苷酸連續觸發兩種髮夾結構(H1和H2)的雜交，產生的雙鏈結構可以與PNA/MNPs@DOPC結合，大幅提高納米顆粒表面的負電荷，從而提高檢測信號。

 


圖1:檢測方案示意圖。(A)使用PNA/MNPs@DOPC檢測核酸原理。(B)基於CHA的信號放大方法。

（來源：Sensors and Actuators B:Chemical）

 

小結：

    修飾有脂質雙層的磁性納米顆粒具有磁性分離、抗汙、探針支架、信號輸出等多種功能，其獨特的表面性質不僅阻止了蛋白質在納米顆粒上的非特異性吸附，而且壓抑了納米顆粒本身的背景信號，為zeta電位定量分析生物分子提供了良好的技術支持。此外，所涉及的檢測方法不需要複雜的操作僅需一步就能對分析物進行檢測，同時無需任何耗時的擴增步驟，即可檢測低至皮摩爾濃度的核酸分子，特別適合於微量核酸的定性或定量分析。最後，納米抗汙平臺的開發與應用為如何構建基於zeta電位的生物傳感策略提供了一種良好思路。


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