作為諾獎級別的技術--CRISPR/Cas9自2012年誕生後，爭議一直不斷！繼2018年4月《Nature Methods》撤稿事件後，6月11日，著名國際期刊《自然醫學》同時刊登了兩篇文章[1,2]，提到Cas9在切割細胞基因組DNA後，p53通路會被激活引發細胞的凋亡反應。這本是很正常的細胞應激反應，然而部分媒體卻發出了：「CRISPR/Cas9編輯成功的細胞很可能是潛在的癌細胞！」這樣的聲音。這再次引起了人們對於這項新技術安全性的質疑，甚至是恐慌。如此嚴重的「缺陷」一時間給Cas9的臨床運用再次蒙上了一層陰影。小編在讀到「Cas9致癌」的報導後特意研讀了《自然醫學》上的兩篇論文，發現有關Cas9可能致癌的報導其實……並不成立。下面就讓我們來分析一下。
上述兩篇文章研究內容很相似，都是主要論證了「在Cas9切割基因組DNA後能夠激活細胞內的p53通路引起細胞周期阻滯和凋亡。」然而在經過國內外一些媒體斷章取義的解讀之後竟成了「被成功編輯的細胞往往會有p53功能缺陷」。這已經偏離了兩篇論文本來的結論。由於這兩篇論文內容相似，篇幅有限，小編主要來說一下來自諾華生物醫學研究所的這篇報導。
看看標題，p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells」，咦？好像和癌症沒有關係麼？我們再來看一下大致內容。
為了能夠提高Cas9在人體多能幹細胞內（hPSC）的基因編輯效率，諾華生物的科學家將dox誘導的iCas9整合入了hPSC內，並利用慢病毒導入sgRNA，每組細胞導入2-3個sgRNA。在dox的誘導下，該系統果然展示出了很高的編輯效率 -- 平均效率超90%。不過好景不長，實驗組大部分的編輯成功的細胞都死了。
那究竟是什麼原因導致細胞死亡？接下來作者進行了分析！
1. 一次導入幾個sgRNA對hPSC來說太多？
研究人員將sgRNA換成一個靶向MAPT的sgRNA（這個基因的缺失不會導致細胞死亡），但即使只切割MAPT這一個靶點，細胞照舊大量死亡。結果如下圖所示：
d 圖， 在誘導Cas9切割MAPT基因後第5天和第10天的編輯效率；e圖，誘導表達Cas9後第三天的細胞鏡檢（明場），可見原本密集的細胞間出現了大量空隙；f 圖，誘導表達Cas9切割MAPT基因後1-7天細胞密度統計圖
2. 難道是細胞暴露在Cas9的條件下太長？還是脫靶效應？
研究人員接連使用了半衰期比DNA更短的Cas9/sgRNA核糖蛋白（RNP），以及脫靶率更低的eCas9 dox誘導系統（ieCas9）。可惜結果都是——細胞大量死亡。更有意思的是，只要這個sgRNA是不切割基因組的非靶向sgRNA，細胞就不會死亡，所以看來也不是Cas9或者sgRNA本身的毒性。結果如下圖所示：
g圖，電轉導入半衰期更短的的Cas9/sgRNA 核糖蛋白複合物後第0.75天和第5天的基因編輯效率。h圖，導入核糖蛋白複合物5天後細胞鏡檢（明場）；i圖，導入核糖蛋白複合物後1-5天
在hESC細胞系中誘導普通Cas9，精準型eCas9或者在8402ips細胞系中誘導精準型eCas9後1-5天內細胞密度統計圖
3. 排除了上述原因後，目標鎖定在了P53蛋白上
研究人員進一步探究細胞死亡的原因，進行了RNA seq以及各個信號通路之間相互作用的計算機模擬，最終將目標鎖定在了p53蛋白上。p53在DNA斷裂修復過程中的作用其實已經比較清楚。DNA在發生斷裂後p53基因會被激活，進而激活下遊的細胞周期調控蛋白p21使細胞被阻滯在G1期，這一機制是為了防止發生斷裂的DNA被細胞盲目複製從而導致基因突變或DNA重排。如果DNA不能被及時修復，就會誘導細胞發生程序化凋亡或者衰老死亡。
為了證明p53通路確實是細胞死亡的原因，研究人員將hPSC的p53敲除，再做基因編輯。果然敲除p53後不但產生indel的細胞不凋亡了，甚至連細胞的HDR水平也提高了。到這裡研究差不多結束了。
基因編輯敲除p53基因後（圖中藍色虛線），再進行DNA切割時細胞的存活率得到提高
利用p53缺失的細胞進行基因編輯連HDR的效率也得到了提升
由此，諾華的科學家得出了這幾個結論
找到了影響多能幹細胞編輯效率的原因 -- p53引起的細胞凋亡；
抑制p53可以提高HDR。當然研究人員也指出，p53基因是DNA完整性的保證，長時間抑制p53可能導致細胞內累計大量的DNA突變。研究人員建議瞬時抑制p53可能是找到DNA完整性和HDR效率間平衡的方法。注意這裡的抑制是加入其它p53的抑制劑。Cas9本身並不能抑制p53通路，更不會導致p53蛋白失活，恰恰相反Cas9是激活p53通路，不然也就不會有文章開頭hPSC編輯效率低這回事了。
那是什麼導致了文章結論被誤讀呢？
原來根源可能在於：研究人員根據此結果對基因治療提出的一些建議。在他們的實驗中，如果多能細胞自身帶有p53突變（有潛在致癌風險），那麼在接受Cas9編輯之後，這些細胞往往更不容易凋亡，他們更容易存活，如果基因編輯將這些細胞富集後再輸回病人體內就糟糕了。所以他們提出在將來需要先對患者的基因組測序，評估p53的自發突變水平再進行基因編輯治療。這本來是一個不錯的建議。
然而媒體在理解上卻大多存在兩個問題：
Cas9的編輯造成了p53的失活。其實在兩篇報導中，都沒有提到這一點。
Cas9編輯成功的細胞都是或者大多都是p53已經失活的。其實這一點取決於研究人員所用細胞系p53的初始突變率，初始突變率越高，編輯過後篩選到的p53突變細胞自然就越多。然而到了現實中，遺傳疾病患者的幹細胞很可能不存在p53蛋白的突變，所以篩選也就無從說起。另外Cas9編輯對p53缺失細胞的富集能力在文章中也沒有更加詳細的實驗。比如在p53自發突變率高於某一個閾值的情況下Cas9編輯才能夠富集大量的癌化細胞。
小編也很好奇，在作者最初的實驗中那些經過Cas9編輯存活下來的少數細胞中p53突變的概率前後到底有多大的變化呢？這些成功編輯的細胞如果繼續培養有多少會累計其他突變？ 另外在不同的細胞系中這種富集作用的強弱也有待驗證。
正如加州大學伯克利分校的Jacob Corn教授所說，「我們在自己的實驗中也發現過p53被激活的現象。所以我們在造血幹細胞的（基因編輯）實驗中很仔細的觀察細胞有沒有生長異常，結果是......並沒有。當然這並不能說明Ihry文是錯的。因為很重要的一點是細胞系不同。
同時也有許多專家們指出，他們尚未在小鼠實驗中看到由於CRISPR基因編輯導致的腫瘤爆發，因此這兩篇論文的發現可能在臨床上的負面影響有限；邦耀實驗室至今也利用CRISPR/Cas9技術構建了多種大/小鼠模型，經過長期飼養觀察，同樣沒有在大/小鼠上觀察到CRISPR/Cas9構建的大/小鼠模型有更容易患癌症的傾向。所以CRISPR編輯過的細胞致癌？可能並不成立…至少現在看來需要更多研究來驗證！
參考文獻：
[1] Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med.2018.
[2] Haapaniemi E, et al.CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response.Nat Med.2018.
邦耀實驗室致力於開發基因編輯技術在腫瘤免疫（CAR-T和TCR-T）和遺傳疾病中的治療，利用完善的新藥研發平臺，進行小分子及抗體藥物研發
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