免疫組化的經驗總結(2)-操作規程

2020-11-25 生物谷

（一）、儀器設備
    1）18cm不鏽鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；
     2）水浴鍋

（二）、試劑
    1）PBS緩衝液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
    2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩衝液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
    3）0.5mol/L EDTA緩衝液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
    4）1mol/L的TBS緩衝液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
    5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。
    6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。
    7）封裱劑：
     a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩衝液（pH9.0～9.5）等量混合；
    b、油和TBS(或PBS)配製。 
    8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於螢光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。

（三）、操作流程
    1、脫蠟和水化
    脫蠟前，應將組織晶片在室溫中放置60分鐘或60℃恆溫箱中烘烤20分鐘。
    1）組織晶片置於二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯後再浸泡10分鐘；
    2）無水乙醇中浸泡5分鐘；
    3）95%乙醇中浸泡5分鐘；
    4）70%乙醇中浸泡5分鐘；
    2、抗原修復
   用於福馬林固定的石蠟包埋組織晶片。
   1）抗原熱修復
   （1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩衝溶液（pH6.0）。蓋上不鏽鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩衝液中浸泡5分鐘，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。
   （2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩衝溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶片加熱10~15分鐘。
   （3）微波熱修復 在微波爐裡加熱0.01M枸櫞酸鈉緩衝溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反覆1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。是以高溫，高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。甲醛和蛋白水解交聯過程中胺基酸側鏈上的某些基團(抗原決定簇)如咪唑、吲哚等基團受到影響，通過120℃高溫或強鹼處理後，可使交聯打開。

   2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
    3、免疫組織化學染色
    SP法
    1）脫蠟、水化；
    2）PBS洗2～3次各5分鐘；
    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
    4）PBS洗2～3次各5分鐘；
    5）抗原修復；
    6）PBS洗2～3次各5分鐘；
    7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多餘液體。
    8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
    9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鐘。
    10）PBS洗3次各5分鐘；
    11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
    12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
    13）PBS洗3次各5分鐘；
    14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
    15）PBS或自來水衝洗10分鐘；
    16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；
    17）自來水衝洗10～15分鐘；
    18）脫水、透明、封片、鏡檢。
    SABC法
    1)脫蠟、水化。
    2)PBS洗兩次各5分鐘。
    3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
    4)抗原修復。
    5)PBS洗5分鐘。
    6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多餘液體。
    7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鐘）。
    8)PBS洗三次每次2分鐘。
    9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
    10)PBC洗3次每次2分鐘。
    11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
    12)PBS洗4次每次5分鐘。
    13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
    14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。
    15)脫水、透明、封片、鏡檢。

 

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