1． 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對於冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對於不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請於購置前注意說明書。
Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適於組織標本的長期保存。
PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適於固定石蠟切片。適於富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。
2．組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。
3．切片時展片：有些組織在切片後難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。
5．蠟塊及切片的保存：最好在4℃保存
6．脫片問題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中最常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合於需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾乾，即可進行下一步。
7．滅活內源性酶：HRP系統：3%雙氧水滅活；AP系統：3%HAc滅活。
8．暴露抗原：對於石蠟切片的免疫組化實驗時，必須採用高溫加熱抗原修復，這將有助於暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的最佳修復液請參閱抗體說明書)。對於不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所採用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉
10．抗體稀釋：應遵循「現用現配」的原則，對於PBS稀釋的抗體一定要當天使用。
11．背景高：在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可採用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。
12．返藍：在蘇木素復染後，可用鹼性緩衝液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。
13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
DAB法 顯示過氧化物酶
〔原理〕 過氧化物酶分解H2O2的過程中，下面反應不直接發生：AH2（供氫體）+H2O2→A（供氫體的氧化物）+2H2O2實驗可知，有稱為複合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氫體）複合體生成，在複合體最後分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學中所使用的供氫體應是含有色原性基團的發色物質，如奈酚和聯苯胺。
免疫組化染色步驟（以ABC法為例）
溶液的配置：
1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 檸檬酸鹽緩衝液：
貯存液：0.1M檸檬酸溶液（A）：21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水
0.1M檸檬酸三鈉溶液（B）：29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水→0.01M檸檬酸鹽緩衝液
3. 0.03% H2O2-甲醇：30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇→充分混勻
4. 20% 甘油：80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水
5. 稀釋抗體：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （臨用前配）
6. 酒精的配置
染色步驟：一步法
1. 載玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中)，二甲苯Ⅱ，室溫 15′。
3. 脫水，100%→95%→85%→75%酒精，每級均為3′。
4. 蒸餾水衝洗，PBS 5′﹡1
5. 微波爐修復抗原：0.01M 檸檬酸鹽緩衝液，99℃ 肺 20′，心腎 12′
6. PBS 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇，室溫20′
8. PBS衝洗，PBS 3′*3，甩幹或紙巾吸去多餘液體（勿碰到組織），PAP Pen劃境線。
9. block solution 封閉抗原，室溫10′。
10. 傾出封閉液，不洗，滴加一抗（60ul），4℃過夜或37℃ 1～2h。
11. PBS衝洗，3′*3。
12. 除去PBS，滴加A增強劑，室溫25′。
13. PBS衝洗，3′*3。
14. 除去PBS，滴加B劑，室溫35′。
15. PBS衝洗，3′*3。同時配置DAB顯色劑。
16. 除去PBS，DAB顯色10′（在顯微鏡下觀察染色程度控制染色時間）。蒸餾水衝洗。
17. 復染：蘇目素均勻滴加2滴，40′′，蒸餾水衝洗，60℃溫水泡半分鐘。
18. 脫水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每級3′。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性樹脂，加蓋玻片（組織部位切勿殘留小氣泡），60℃ 0.5h烘乾。
結果：棕褐色反應產物代表抗原X的定位。
拍照
1. 更換樣品時，除了調整焦距和視野外，顯微鏡上的其他部件都不能動！所有的樣品必須一次拍攝完全。特別是在拍攝過程中，不要一會用高倍鏡，一會用低倍鏡，來回切換物鏡。
2. 數位相機必須設置為手動曝光，並且保持每張照片用同樣的曝光條件，同樣的曝光時間，同樣的光圈。特別要注意的是，一定要將數位相機的自動白平衡功能給關掉
3. 免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應儘可能呈現純白色。測量其灰度應在250左右。如果呈現淡藍色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍。