蟲茶的研究進展
鄧天福 莫建初
(浙江大學城市昆蟲學研究中心，杭州310029)
中國是一個茶葉生產和消費大國。市場上茶的種類繁多，其中，「非茶之茶」獨具特色，它們不同於普通茶葉的範疇，但卻以保健茶或藥用茶的形式出現，蟲茶就是其中的一種。蟲茶在我國的生產和飲用有著悠久的歷史，屬我國湘桂黔山區特有的林業昆蟲產品，深受東南亞、港澳華僑的青睞，已經成為我國傳統出口的名牌特種茶。在講究天然與保健，特別是提倡綠色食品的今天，作為特種保健茶的蟲茶無疑具有廣闊的發展前景。本文將對我國蟲茶的研究情況進行綜述。
1 蟲茶的基本知識
蟲茶的由來
蟲茶的由來已無從考證，主要有兩種說法。其一是傳說一位窮苦的山民吃不起茶葉，用化香樹葉代替茶葉作飲料，後來不請自來的化香夜蛾在這位山民積貯的樹葉上產卵繁殖，終日勞累的山民開始熬茶時並未注意到這些變化，連葉帶蟲全放入鍋裡，直到茶水沸騰、香氣四溢時才引起了注意。這位山民通過細心的觀察、思索和實踐，終於發明了蟲茶(白石仁，2004)。另一種說法是清代乾隆年問，湘西城步苗民因不滿封建統治揭竿起義，朝廷派兵前來鎮壓，將苗民圍趕入深山。苗民只能依靠採野菜摘茶葉等充飢，這年野菜因乾旱而枯死，茶葉全被山蟲啃噬一光，剩下的只是遍地蟲屎渣。飢不擇食的苗民便將這種蟲屎渣撮來衝水喝，發覺其味道還不錯，並命名為「蟲茶」。其後，該蟲茶一度成為朝廷貢品(尹建德，1989)。
2 蟲茶的區別
蟲茶是一種產於我國的區別於普通茶葉範疇，以昆蟲食用茶葉或其他葉片排洩的蟲糞顆粒製成的特殊茶飲料，主要產地位於湖南、貴州、廣西等地的偏遠少數民族地區。因寄主植物種類及產蟲茶昆蟲的種類不同，形成了不同的蟲茶種類。
目前市場蟲茶大致分為以下幾類：䖝龍珠蟲茶、三葉蟲茶、化香蟲茶、老鷹蟲茶。
蟲茶既是傳統飲料又是傳統中藥，明代李時珍《本草綱目》中早已有關於蛀蟲和蟲茶的記載：「茶蛀蟲，此裝茶籠內蛀蟲也，取其屎用」、「蛀屑（主治）聤耳出汁」。據湖南省林科所測定：蟲茶富含蛋白質、18種以上胺基酸、單寧、維生素C和各類微量元素。具有清熱、解毒、健胃、止血、護肝、降壓降脂、清除自由基和抗癌的效果。
䖝龍珠蟲茶因其寄主植物為存放時間很長的安化黑茶較其他種類蟲茶的寄主植物為植物嫩葉有所不同，其藥用功效更勝一籌。該茶品除有其他蟲茶的功效外，更添加了黑茶的藥理特徵。䖝龍珠蟲茶所用黑茶為有性繁殖的成熟茶葉（必須是完整的茶葉生長周期），原因是由於茶多酚在成熟茶葉中含量最高，而且會隨茶葉原料的老化而增加。用同等嫩度的鮮葉分別加工成紅茶、綠茶和黑茶，其中黑茶茶多糖含量最高，綠茶次之，紅茶最低。對幾種茶類的茶多酚含量測定的結果表明，黑茶在發酵過程中由於糖苷酶、蛋白酶、水解酶的作用，形成了相對長度較短的糖鏈和肽鏈，從而更容易被吸收，且生物活性更強，這是黑茶降血糖效果優於其他茶類的原因之一。安化茯磚、千兩茶中特有的金花（冠突散囊菌）亦是其他茶類中不存在的益生菌，它只能在安化黑茶特定的加工工藝和安化特殊的地理氣候環境中共同作用下才能產生。由於此成分僅在千年靈芝上有發現，所以經長年存放的黑茶其藥效和千年靈芝有異曲同工之處。
䖝龍珠蟲茶和其他蟲茶在形狀上都為圓柱狀，䖝龍珠蟲茶的茶粒較為粗大，完全能達到蟲茶的甲級標準，茶粒長度到達1-1.2mm以上的要求。因其原料為安化黑茶，所以其茶粒外觀顏色呈黑色，較其他品種蟲茶顏色深。
從茶藝的形、色、味等方面比較䖝龍珠蟲茶和其他品種蟲茶有以下區別：
品種
取食原料
形狀
顏色
湯色
䖝龍珠蟲茶
安化黑茶
圓柱
深褐至黑色
紅黃色亮度高
三葉蟲茶
三葉海棠
圓柱
淺褐至深褐
紅黃色
化香蟲茶
化香樹葉
圓柱
深褐
清褐色
老鷹蟲茶
樟科老鷹茶
圓柱
淺褐至深褐
紅黃色
3 本文對䖝龍珠蟲茶醇提取物對超氧陰離子和羥基自由基的清除作用進行了研究。
3.1 方法：以䖝龍珠蟲茶為原料，以不同濃度的乙醇溶液粗提物，其醇制浸膏採用鄰苯三酚法測定O2—、鄰二氮菲法測OH體系。
3.2 結果：䖝龍珠蟲茶40%乙醇提取物得率為最高。超氧陰離子的清除趨勢、活性不一。清除OH的能力依次為：無水乙醇提取物＞20%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞60%乙醇提取物＞40%乙醇提取物。
3.3 結論：無論是何種濃度乙醇提取物都表現出了良好的清除超氧陰離子和羥基自由基的能力。各種濃度相比之下，20%乙醇提取物對超氧陰離子清除能力較好，無水乙醇提取物對羥基自由基的清除能力較好。
3 This paper studies on the scavengingeffects of chonglongzhu-tea-Sandy-tea ethanol extract on Super oxide Anion andHydroxyl Radical.
3.1 Methods: For the materials with chonglongzhu-tea-Sandy-tea,then using pyrogallol method to measure super oxide anion radical (O2•－), orthophenanthroline reaction methodto measure hydroxyl radical(·OH)by the different solvent concentrationextracts.
3.2 Results: The rate of 40% Ethanolextract is the highest. The clear trend and active of Super oxide anion isdifferent. The scavenge ability of different solvent concentration extract with· OH isEthanol extract＞20%Ethanol extract＞80%Ethanol extract＞60%Ethanol extract＞40%Ethanol extract.
3.3 Conclusion: Either Super oxide anion orHydroxyl radicals will be scavenged very well by any concentration ethanolextract. Compared with various concentrations, 20%Ethanol extract is better onscavenging Super oxide anion and Ethanol extract is better on scavengingHydroxyl radical.
4 䖝龍珠蟲茶
蟲茶，是我國湘黔川渝山區特有的林業資源昆蟲產品，為一些鱗翅目類昆蟲的幼蟲啃食腐熟樹葉後的排洩物，同時也是我國的一種傳統中藥，在我國民間有著傳統飲用的習慣。早在明代李時珍的《本草綱目》中有記載：「此裝茶籠內蛀蟲也，取其屎用，蛀屑（主治）聹耳出汁，日日繳淨，摻之……」。據近年來的研究發現，蟲茶的營養價值高於普通茶，蟲茶具有胺基酸含量高、種類豐富、比例合理的特點，富含對人體有益的礦物質及微量元素。由於蟲茶具有豐富的營養成分，使蟲茶更被賦予了比普通茶葉更多的保健功能，適量泡飲蟲茶，能提神醒腦、解熱驅毒、收斂止血、降壓去脂、健脾和胃等，對治療消化不良、鼻衄、痔瘡出血、牙齦出血和癤腫有確切療效，對預防高血壓、高血脂和冠心病也有一定作用。
自由基(Free Radical)又稱游離基，指外層軌道含有未配對的電子、原子團或特殊狀態的分子。由於帶有不成對電子具有配對的趨向，極易發生得電子或失電子的反應，化學性質活潑，存在時間僅10-6～10-8s，一旦生成又立即引發其他物質生成自由基，由此引發連鎖反應[8]。在生物體內多種物質均可產生自由基，但研究最多、作用範圍最廣泛的就是氧自由基，它們無論是在機體的正常代謝還是病理變化中都極為重要。主要包括：超氧陰離子(O2•－)，羥基自由基(·OH)，單線態氧(1O2)和過氧化氫(H2O2)具有類似氧自由基的性質和作用，通稱活性氧或氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。自由基作為致病因子幾乎和人類常見的幾種主要疾病都有著密切的關係，近20年來活性氧和自由基的研究成為現代生命科學的前沿和熱點，但現在還未見對蟲茶抗氧化方面的研究，而抗氧化是開發利用蟲茶的一個重要方面。故本實驗針對䖝龍珠蟲茶醇提物對超氧陰離子和羥基自由基的清除能力方面做出研究。
5 材料與方法
5.1.1實驗材料及處理
湖南安化的䖝龍珠蟲茶，採用鼓風機常溫下鼓風乾燥，高速粉碎機粉碎，過40目篩，入棕色乾燥玻璃器皿中儲存，待用時取出。
5.1.2實驗試劑
實際名稱 規格 產地或生產廠家
磷酸二氫鈉 AR 重慶北碚化學試劑廠
磷酸氫二鈉 AR 重慶北碚化學試劑廠
鄰苯三酚 AR 貴州遵義佳宏化工有限公司
鹽酸 AR 成都科龍化工試劑廠
硫酸亞鐵 AR 北碚化學試劑廠
無水乙醇 AR 成都科龍化工試劑廠
30%過氧化氫 AR 重慶川東化工（集團）有限公司
鄰二氮菲 AR 重慶北碚化學試劑廠
5.1.3實驗儀器
儀器與設備名稱 型號 產地或生產廠家
電熱恆溫鼓風乾燥箱 101-3-S 上海躍進醫療器械廠
數顯恆溫水浴鍋 HH-2 金壇富華儀器有限公司
高速粉碎機 GWJ 江省上虞市沙篩廠
精密pH儀 PHS-3B 上海精科雷磁儀器廠
紫外可見分光光度計 752 上海精密儀器廠
旋轉蒸發儀 RE-86 上海本波儀器有限公司
電子天秤 JA2004 上海精密科學儀器廠
5.2 實驗方法
5.2.1䖝龍珠蟲茶的粗提取
䖝龍珠蟲茶（過40目篩）20g以1∶10的料液比分別加不同濃度乙醇50℃回流三次，回流時間分別為1h，40min，30min，合併三次所得的浸液，過濾，於50℃減壓濃縮，得醇制浸膏。
5.2.2鄰苯三酚法測定超氧陰離子自由基體系[9-10]
5.2.2.1 測定的步驟
取4.5mL pH8的0.05mol/L磷酸鹽緩衝液置於25℃水浴中加熱20min，分別加入1ml試樣和0.4ml25mmol/l鄰苯三酚溶液，混勻後於25℃水浴中反應5min，加入80mmol/l HCl 1ml終止反應，並搖勻，反應3min，在波長420nm處測定。
5.2.2.2 計算公式
A1：4.5ml pH8的0.05mol/l磷酸鹽緩衝液+1ml試樣+0.4ml 25mmol/l鄰苯三酚溶液+1ml 80mmol/lHCl
A2: 4.5ml pH8的0.05mol/l磷酸鹽緩衝液+1ml試樣+1ml80mmol/l HCl
A 3 : 4 . 5 m l p H 8 的0 . 0 5 m o l / l 磷酸鹽緩衝液+1ml無水乙醇+0.4ml25mmol/l鄰苯三酚溶液+1ml80mmol/lHCl
註：A3中用無水乙醇代替醇提物，其他需要用乙醇替代的地方其替代的乙醇濃度與醇制浸膏的乙醇濃度相等
6 鄰二氮菲法測定羥基自由基體系
6.1 測定的步驟
參考文獻並略作改進，利用Fenton法反應產生OH。在10mL的試管中依次加入1.0mL 0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液、2 . 0 m L 的P B S 緩衝溶液(pH值7.4)和1.0mL乙醇溶液，充分混合後，加入1.0mL0.75mmol/LFeSO4溶液，邊加邊搖勻後，加入1.0mL0.015%H2O2，置於37℃水浴反應60min，以1∶2（體積比）的緩衝溶液和乙醇溶液作參比液，在536nm測其吸光度A3；按上述操作步驟，用1.0mL乙醇溶液代替1.0mL0.015% H2O2，在536nm測其吸光度A2；用不同濃度的樣品代替1.0mL乙醇溶液，以1∶2∶3（體積比）的樣品、緩衝溶液、乙醇溶液作參比，在536nm處測其吸光度A1。按5.2.2.2計算清
除率。
6.2 計算公式
式中：
A1、A3、A2分別為加入樣品、不加樣品及不加樣品和H2O2體系的吸光度值。
7 結果與分析
7.1 䖝龍珠蟲茶按不同溶劑濃度提取的得率
按照5.2.1的方法，將提取溶劑的濃度設定為5個濃度，即用無水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇、20%乙醇按5.2.1的方法提取，減壓乾燥濃縮的醇制浸膏稱重，得到䖝龍珠蟲茶浸膏得率如圖1。通過圖1明顯可以看出因為乙醇溶液濃度不同，所得到的浸膏淨重也不相同。隨著乙醇濃度的增加，其浸膏得率先升高後下降，在50%左右的浸膏得率相近且最高。
圖1 不同溶劑濃度提取䖝龍珠蟲茶得率
Fig.1The rate of chonglongzhu-tea-Sandy-tea by Solvent
extractionof different concentrations
7.2 䖝龍珠蟲茶於不同濃度時對超氧陰離子自由基體系的清除作用
取按5.2.1製備的䖝龍珠蟲茶不同乙醇濃度提取物，以相應提取液配製不同濃度的提取液，提取物濃度：0.5mg/mL、2mg/mL、3.5mg/mL、5mg/mL、6.5mg/mL。測定䖝龍珠蟲茶不同溶劑提取液對O2—的清除作用，按5.2.2方法測定，計算其清除率，得結果如表1。各濃度提取物對超氧陰離子都有良好的清除率，其總體趨勢隨濃度的增大而增強。無水乙醇提取物在不同濃度梯度的清除率一直呈上升趨勢，在6.5mg/mL時，清除率達到94.97%；20%乙醇在2mg/mL濃度之後清除能力迅速提高。
對不同提取溶劑及不同提取物濃度處理所得到的對超氧陰離子的清除率進行方差分析，得表2所示，自由度為4，總變異為16，查F值表，分子自由度為4、分母自由度為16時，其概率為0.05時F值為3.01，概率為0.01時F值為4.77。材料濃度的F值為7.16，為極顯著性差異。溶劑濃度不同時其F值為0.99，無顯著性差異。表明在對超氧陰離子清除作用方面，材料濃度顯著性影響清除率。可能的原因是在不同的濃度提取出的水溶性或醇溶性抗氧化物質可能會出現不同的抗氧化活性高峰。
7.3 䖝龍珠蟲茶於不同濃度時對羥基自由基體系的清除作用
取按5.2.1製備的䖝龍珠蟲茶不同溶劑提取物，以相應提取液配製不同濃度的提取液，提取物濃度： 0 . 5 m g / m L 、0 . 8 5 m g / m L 、1 . 2 0 m g / m L 、1 . 5 5 m g / m L 、1 . 9 0 m g / m L。測定䖝龍珠蟲茶不同溶劑提取液對· O H 的清除作用， 按5 . 2 . 3 方法測定，計算其清除率，結果如表3。䖝龍珠蟲茶不同濃度乙醇提取物對羥自由基均有一定清除作用，不同濃度乙醇提取物均可有效清除羥基自由基，均隨處理濃度升高，清除率增加。在本實驗條件下，以無水乙醇組、80%乙醇組和20%乙醇組清除效果較好，分別為22.91%-94.41%、19.19%-84.09%以及13.23%-89.17%。
經對不同提取溶劑及不同提取物濃度處理所得到的對羥基自由基的清除率進行方差分析，結果見表4，自由度為4，總變異為16，查F值表，分子自由度為4、分母自由度為16時，其概率為0.05時F值為3.01，其概率為0.01時F值為4.77。材料濃度的F值為56.82，為極顯著性差異。溶劑濃度不同時其F值為34.09，為極顯著差異。表明在對羥基自由基清除作用方面，材料濃度和溶劑濃度顯著性影響清除率。可能的原因是實驗材料中抗氧化物質多種多樣，不同的溶劑濃度提取出的水溶性或醇溶性抗氧化物質可能會不一樣。
經對不同濃度乙醇提取物對羥基自由基的清除率進行回歸分析，結果如圖2，表5，表明不同濃度乙醇提取物對羥自由基的清除率與提取物濃度間顯著相關（p<0.05）。
經回國方程計算羥基自由基的半數清除率，結果如圖3所示：無水乙醇提取物對羥基自由基的半數清除率最高。不同濃度提取物對羥基自由基體系的清除作用活性高低為：無水乙醇提取物＞20%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞60%乙醇提取物＞40%乙醇提取物。
表1 不同濃度乙醇提取物對超氧陰離子自由基體系的清除作用
Tab1Scavenging effect of Ethanol extract of chonglongzhu-tea-sandy-tea with O2—
表2 對超氧陰離子的不同醇提取物濃度和不同乙醇濃度的雙因素方差分析表
Tab.2Double anova table of different concentration of alcohol and ethanolconcentration with O2—
表3 不同濃度乙醇提取物對羥基自由基體系的清除作用
Tab.3Scavenging effect of Ethanol extracts of chonglongzhu-tea-sandy-tea with ·OH
表4 對羥基自由基的不同醇提取物和不同乙醇濃度的雙因素方差分析表
Tab.4Double anova table of different concentration of alcohol and ethanolconcentration with ·OH
圖2 䖝龍珠蟲茶不同濃度提取物對羥基自由基體系的清除作用
Fig.2Scavenging effect of solvent extracts of chonglongzhu-tea-sandy-tea with ·OH
表5 䖝龍珠蟲茶不同濃度提取物對羥基自由基體系的清除作用
Tab.5Scavenging effect of solvent extracts chonglongzhu-tea-sandy-tea with ·OH
圖3 䖝龍珠蟲茶不同濃度提取物對羥基自由基體系的清除作用
Fig.350%Scavenging effect of solvent extracts of chonglongzhu-tea-sandy-tea with ·OH
8 結論
（1）通過對䖝龍珠蟲茶的不同濃度醇提物體外抗氧化活性研究發現，40%乙醇提取物得率最高。
（2）用不同溶劑濃度醇提取物對超氧陰離體外抗氧化實驗無太大規律性，表現出不同的抗氧化活性。其方差分析表明，據其材料濃度不同表現出極顯著差異，溶劑濃度不同差異不顯著。推測因為提出的水溶性抗氧化物和醇溶性抗氧化物種類、含量不同，導致清除超氧陰離子的強度趨勢和活性強度不一。
（3）用不同乙醇濃度的䖝龍珠蟲茶提取物對羥基自由基體系的體外抗氧化實驗表明：在一定乙醇濃度條件下，醇提物的清除率隨蟲茶濃度的升高而升高。在對羥基自由基清除作用方面，材料濃度和溶劑濃度顯著性影響清除率。對於不同溶劑濃度來說，其清除率能力強弱為：無水乙醇提取物＞20%乙醇提取物＞80%乙醇提取物＞60%乙醇提取物＞40%乙醇提取物。
（4）綜合以上實驗結果分析，無論是何種濃度的乙醇作提取液都表現出了良好的清除超氧陰離子和羥基自由基的能力。各種濃度相比之下，20%乙醇提取物對超氧陰離子清除能力較好，無水乙醇提取物對羥基自由基的清除能力較好。
9.䖝龍珠蟲茶對癌細胞生長和腫瘤轉移抑制作用的研究
研究對市售的䖝龍珠蟲茶進行TCA8113 人舌鱗癌細胞體外抗癌效果和體內抗轉移效果評價。通過MTT 試驗、DAPI螢光染色分析和RT-PCR 分析說明其體外抗癌效果，並通過建立動物模型分析其體內抗腫瘤轉移效果。通過用50 μg/mL、100 μg/mL 和200μg/mL三種不同濃度的蟲茶對TCA8113 人舌鱗癌細胞體外增殖的抑制效果的研究表明，200 μg/mL 濃度的蟲茶(81%)表現出對該癌細胞有最強的生長抑制效果。通過用以上三種不同濃度的蟲茶對該癌細胞的mRNA 表達影響的研究表明，200 μg/mL 濃度的蟲茶比100μg/mL 和50 μg/mL 蟲茶具有更強的細胞誘導凋亡效果，而且隨著䖝龍珠蟲茶濃度增加，Bax、caspase-3和caspase-9 的mRNA 表達增強，而Bcl-2 表達減弱。通過BALB/c 小鼠腫瘤轉移的研究表明，蟲茶也能抑制由26-M3.1 結腸癌細胞誘導的腫瘤轉移。對蟲茶進行了體外抗癌效能和動物體內抗腫瘤轉移的比較實驗，䖝龍珠蟲茶是一種具有抗癌效果的功能性食品。
In this study, chonglongzhu-tea-sandy-teaproduct was purchased for the evaluation of in vitro anticancer effect onTCA8113 human tongue squamous carcinoma cells and in vivo anti-metastaticeffect．By using MTTassay, apoptosis analysis by DAPI staining and RT-PCR assay, and western blotassay were employed to check the in vitro anticancer effect and in vivoanti-metastatic effect of Sandytea at different concentration(50, 100 and 200 μg/mL) using animal models.Results showed that 200 μg/mL of sandy tea (81%) had the best inhibitory effectand apoptosis-inducing activity on TCA8113 human tongue squamous carcinomacells compared to those samples at other concentrations.With increasing the teaconcentrations, mRNA expressions of Bax, caspase-3 and caspase-9 wasup-regulated, but Bcl-2 expression was down-regulated. BALB/c tumoranti-metastasis test showed that sandy tea inhibited in vivo tumor metastasisinduced by colon 26-M3.1 cells in BALB/c mice. These results suggest that chonglongzhu-tea-sandy-teahad potential as an anticancer functional food.
10.蟲茶分類來源
蟲茶是一種產於我國的區別於普通茶葉範疇，但卻以保健茶或者藥用茶形式飲用的以昆蟲食用葉片排洩的蟲糞粒製成的特殊茶飲料[1]。用來生產蟲茶的昆蟲已發現的有夜蛾科弓須亥夜蛾Hydrillodes morose Butler.（化香夜蛾、黃紋淡黑夜蛾）；雪疽夜蛾Nodaria niphona Butler. ；螟蛾科米縞螟Aglossa dimidiate Haworth.（米黑蟲；黃條谷螟Herculia glaucinalis L.
（谷粗喙螟）以及白條谷螟（Fujimacia bicoloralis Leech.）。
關於蟲茶保健功效的研究越來越受到關注。目前對於蟲茶的保健功效已經有一定的認識。蟲茶作為傳統飲品和中藥，具有清熱、去暑、解毒、健胃、助消化等功效，對腹瀉、鼻衄、牙齦出血和痔出血均有較好療效，是一種很好的醫藥保健飲料[4]。有些蟲茶對治療腸風下血、產後下痢、口瘡耳腫、齒齦風毒等有一定的效果，有些蟲茶還具有護肝、降壓降脂、潤膚等功效。蟲茶中含有K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Zn等共17種礦物質元素，其中約有10 種元素為人體必需微量元素，且Fe、Zn、Ca、Mg 等元素含量較高，優於一些名優茶。此外，不同蟲茶中還富含有粗蛋白、粗纖維、脂肪、茶多酚、咖啡鹼、糖分、維生素和胺基酸。為了驗證蟲茶的抗癌效果，研究初步驗證䖝龍珠蟲茶對TCA8113人舌鱗癌細胞體外抗癌功能性作用和利用小鼠動物模型進行蟲茶的抗腫瘤腫瘤轉移的研究。
11 材料與方法
11.1 樣品
䖝龍珠蟲茶：市售原產安化蟲茶，進行冷凍乾燥後用沸水3次提取後蒸乾，將蒸乾後的水提物用DMSO（二甲基亞碸）全部溶解後冷藏保存待用。
11.2 癌細胞株
TCA8113 人舌鱗癌細胞(TCA8113 Human Tongue Squamous CarcinomaCells)購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。26-M3.1 結腸癌細胞(26-M3.1 colon carcinoma cells)由韓國釜山大學食品營養學科提供。
11.3 試劑
DMSO，日本純正化學株式會社，日本；D-Biotin、NADP(sodium salt)、L-histidine·HCI (monohydrate)、D-glucose-6-phosphate(mono sodium salt) 、4,6-diamidino-2-phenylindole 和Paraformaldehyde 、ethidium bromide，Sigma 公司，美國；EMEM 培養液、RPMI 1640、0.05% trypsin-0.02% EDTA、Fetal bovine serum (FBS)和100 unit/mL Penicillin-Streptomycin，
GIBCO 公司，美國。Trizol reagent，Invitrogen公司，美國，蛋白檢測試劑盒，Bio-Rad 公司美國，western抗體，Santa Cruz 公司，美國。
11.4 儀器與設備
HB-205SW 恆溫水浴震蕩器，Hanbeak科學株式會社，韓國；R-114 旋轉蒸發儀，Buchi 公司，瑞士；VS-15CFN 冷凍離心機，Vision 科學株式會社，韓國；HB-402V 超淨工作檯，Hanbeak 科學株式會社，韓國；MC096 二氧化碳培養箱，三洋電機株式會社，日本；PM-1OAK 倒置顯微鏡，奧林巴斯株式會社，日本；Elx800 酶標儀，Bio Tekinstruments公司，美國；BXS0螢光顯微鏡，奧林巴斯株式會社，日本。
11.5 實驗動物
BALB/c 小鼠購於重慶醫科大學實驗動物中心，分為對照和樣品組，每組10 只。各組小鼠在溫度為23±1 ℃，相對溼度50±5%環境下飼養，小鼠自由攝取飲水和小滑鼠準飲食。
11.6 方法
11.6.1癌細胞體外增殖抑制試驗（MTT 法）
在10%滅活小牛血清的RPMI 1640 培養液中接種復甦後的TCA8113 人舌鱗癌細胞，癌細胞在5%CO2、37℃條件下的培養箱中培養，2~3 d 更換一次培養基，一周進行傳代一次。將培養好的癌細胞按濃度1×104個/mL 每孔接種於96孔培養板，每孔接入細胞懸濁液180 μL。接種後的細胞在5% CO2、37℃條件下培養24 h。樣品設三個濃度量組，細胞貼壁後按每孔20 μL加入不同濃度的樣品，使96 孔板內不同孔內濃度分別為50 μg/mL、100 μg/mL 和200 μg/mL。經過48h 培養後，吸出孔內上清液，每孔加入質量濃度為5 mg/mL的MTT 試劑200μL 後繼續培養4 h，然後再次吸出孔內上清液後，按每孔200 μL 加入DMSO 後充分震蕩30 min，用酶標儀在540 nm 波長下測定各孔OD值，按公式：抑制率(%)=[(空白孔OD 值-樣品孔OD值)/空白孔OD 值]×100%計算細胞增殖抑制率。
11.6.2反轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測
表6 RT-PCR 實驗引物序列表
Tab.6 Primers of RT-PCR experiment
各組癌細胞在同等條件下，用RNAzol 試劑製備癌細胞的總RNA。定量分離到RNA 後，用oligodT在AMV 逆轉錄酶作用下製備ss cDNA，然後以該cDNA 為模板，反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增Bax，Bcl-2 ，caspase-3,9 基因引物（表6) 。持家基因lyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)作為對照內參照。以上程序結束後，以含濃度溴化乙錠的1%瓊脂電泳檢查PCR 擴增產物。
11.6.3 BALB/c 小鼠腫瘤轉移實驗
將 26-M3.1 結腸癌細胞接種於EMEM培養液中，在5% CO2、37 ℃充分溼化條件下的培養箱中培養。按2.5×104/每隻細胞量對6周齡雌性BALB/c 小鼠實施尾部靜脈注射，在隨後兩周內按400、800 和1600mg/kg 濃度蟲茶水提物對BALB/c 小鼠每天實施灌胃一次。兩周後進行解剖將小鼠肺部用Bouin'ssolution固定24 h，隨後對肺部轉移的腫瘤個數進行測算。抑制率(%)=[(空白組轉移腫瘤個數-樣品組轉移腫瘤個數)／空白組轉移腫瘤個數]×100%。
11.7 數據統計
使用 SAS 統計軟體對所得到數據採用one-way ANOVA 法分析數據結果是否存在差異性（p<0.05）。
12 結果與討論
12.1 䖝龍珠蟲茶對TCA8113 人舌鱗癌細胞體外增殖的抑制效果採用 MTT法對蟲茶的TCA8113細胞體外增殖抑制效果進行研究。用200 μg/mL濃度蟲茶水提物溶液處理貼壁TCA8113細胞時，䖝龍珠蟲茶表現出很強的抑制率，抑制率達到83%。以100 μg/mL和50μg/mL 濃度蟲茶水提物溶液處理TCA8113 細胞時，癌細胞生長增殖抑制率分別達到60%和23%（表7）。可以看出，蟲茶水提物對TCA8113人舌鱗癌細胞具有生長增殖抑制效果，並且作用濃度越高生長抑制效果越明顯。
表7 MTT 法測定蟲茶對TCA8113人舌鱗癌細胞的生長抑制效果
Tab.7Inhibition effect of sandy tea on growth of TCA8113 human tongue squamouscarcinoma cells evaluated by MTT assay
註：1)均值±標準偏差；a~d 不同字母表示差各組數據平均值顯著性差異（p<0.05）。
12.2䖝龍珠蟲茶對TCA8113人舌鱗癌細胞的Bax 和Bcl-2 基因的mRNA 表達影響
在適宜的病理或生理環境中，細胞在基因調控下主動死亡的過程即為細胞凋亡。凋亡基因發生突變和表達異常的情況下能切斷癌細胞的凋亡，出現這種情況的時候癌症便開始發生。Bcl-2基因是一種抑制細胞凋亡的基因，Bax 是一種促進細胞凋亡的基因。它們可以共同作用產生二聚體。當Bax基因的量大於Bcl-2 基因的時候，Bax基因和二聚體的量增加，此過程發生能促進癌細胞凋亡。
圖 4 經蟲茶處理後TCA8113 人舌鱗癌細胞的Bax 和Bcl-2 的mRNA 表達
Fig.4Effects of sandy tea on the mRNA expression of Bax and Bcl-2 in TCA8113 humantongue squamous carcinoma cells
䖝龍珠蟲茶水提取物以不同濃度對TCA8113人舌鱗癌細胞進行處理。在200 μg/mL濃度下，經過蟲茶水提物處理的TCA8113 人舌鱗癌細胞的Bax 因子表達最強，在100 和50 μg/mL 濃度處理下的TCA8113 人舌鱗癌細胞中的Bax 表達隨著濃度的降低表達強度也隨之降低；經不同質量濃度蟲茶水提物處理後，Bcl-2因子的mRNA 表達隨著蟲茶濃度的升高表達反而減弱（圖4）。通過實驗檢測結果分析表明增加作用於癌細胞的蟲茶水提物濃度，癌細胞的Bax 基因表達得到加強，Bcl 基因的表達開始減弱，此機制可認定為蟲茶促進了癌細胞凋亡的過程，從而起到了抗癌效果。
12.3 䖝龍珠蟲茶對TCA8113 人舌鱗癌細胞的caspase-3 和caspase-9 基因mRNA表達影響
Caspase基因可以選擇性的對一些蛋白質進行切割，造成癌細胞的凋亡狀況，caspase-9 基因是凋亡過程中的上遊半胱天冬酶，caspase-3是下遊半胱天冬酶，caspase-9 作為啟動性半胱天冬酶，caspase-9基因表達的加強能加強對下遊caspase-3的刺激，caspase-3 可以直接降解胞內的結構和功能蛋白，引發癌細胞凋亡的發生。蟲茶水提取物對TCA8113人舌鱗癌細胞處理後觀察癌細胞的凋亡因子caspase-3和caspase-9的表達得到與Bax因子表達相似的結果，隨著處理細胞樣品濃度的增加caspase-3和caspase-9也隨之增加，200μg/mL濃度處理時，表達最強(圖5)。由此可以看出，經過200 μg/mL濃度蟲茶水提物處理的TCA8113人舌鱗癌細胞表現出最強的細胞凋亡作用。通過實驗檢測結果分析表明蟲茶對癌細胞的半胱天冬酶基因作用效果能促進癌細胞的凋亡。
圖 5 經蟲茶處理後TCA8113 人舌鱗癌細胞的caspase-3和caspase-9 的 mRNA 表達
Fig.5Effects of sandy tea on the mRNA expression of caspase-3 and caspase-9 inTCA8113 human tongue squamous carcinoma cells
12.4 䖝龍珠蟲茶對小鼠的腫瘤轉移抑制效果
在臨床治療中多數腫瘤治療失敗的原因是因為轉移，因此抑制腫瘤轉移是治療癌症的重要手段。腫瘤轉移是指惡性腫瘤細胞離開原發部位，通過血液、淋巴運轉或直接播散到不連續的組織器官中繼續生長，形成與原發腫瘤病理類型相同的腫瘤。
表8 蟲茶對26-M3.1結腸癌細胞誘導產生的Balb/c小鼠腫瘤轉移的抑制效果
Tab.8Inhibitory effect of sandy tea on the metastasis of tumors produced by colon26-M3.1 cells in Balb/c mice
註：1) 均值±標準偏差；a-c 不同字母表示差各組數據平均值顯著性差異（p<0.05）。
通過對 BALB/c 小鼠建立腫瘤轉移動物模型，觀察蟲茶對小鼠腫瘤轉移的抑制效果可以更有效的驗證蟲茶的抗癌效果。26-M3.1 結腸癌細胞誘導轉移後，小鼠均發生腫瘤肺轉移，對照組小鼠肺部形成57±6個轉移腫瘤，蟲茶樣品組小鼠按400、800 和1600mg/kg 灌胃兩周，小鼠肺部分別形成54±4、48±6 和40±5 個轉移腫瘤，濃度由低到高對腫瘤轉移的抑制率分別為5.3、15.8 和29.8%（表8）。可以看出蟲茶可以明顯的抑制腫瘤轉移的發生。
13 結論
採用MTT 法用不同濃度䖝龍珠蟲茶水提物對TCA8113人舌鱗癌細胞進行處理以研究蟲茶的體外抗癌效果，發現蟲茶水提物的濃度與抗癌效果具有直接關係，濃度越大，癌細胞增值抑制效果越明顯。隨著處理癌細胞的蟲茶水提物濃度的增加，TCA8113 人舌鱗癌細胞的Bax 基因的mRNA 表達增強，Bcl-2 基因的mRNA表達減弱，同時caspase-3和caspase-9 基因的mRNA表達都隨之增強，這些機制表明癌細胞的凋亡效果增強，抗癌效果加強。由此可以看出蟲茶可以起到促進癌細胞凋亡的作用。此外，通過BALB/c 小鼠體內抗腫瘤轉移實驗，得出蟲茶可以明顯地抑制腫瘤轉移的發生,而且隨著蟲茶濃度的增加，抑制效果明顯增強。蟲茶對人體的臨床作用有待更深層次的研究。
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