用EBV轉染淋巴細胞建立永生化細胞株的方法

首頁

» 用EBV轉染淋巴細胞建立永生化細胞株的方法

用EBV轉染淋巴細胞建立永生化細胞株的方法

來源：丁香園論壇 2007-01-09 20:51

一、  試劑
1、  淋巴細胞分離液：避光4度保存，用前在37度水浴中加溫。整個分離過程中，溫度應控制在8-28度，溫度過高或過低均影響分離質量。
2、  全培養基（用前配置）：RPM1640培養基，內含20%胎牛血清（Gibco）{56℃滅活30分鐘}，1.6-1.8% 1M的HEPES，1.2% 0.2mol/L穀氨醯胺，1%青黴素和鏈黴素。
3、  環胞酶素A（CyA）：5ml(250mg)/瓶，用1640培養基稀釋成0.2mg/ml，使用時終濃度為2ug/ml(0.5%)。
4、  EBV液購自中國科學院遺傳所，儲存於零下80度。使用時從冰箱中取出，37度迅速融化，用0.22um的濾膜過濾，不要超過0.5-1小時。
二、  建株方法
1、  取外周血3-4ml，肝素抗凝（血液室溫可放置48小時），應用液濃度5u/ml，可加入5-10ml外周血。
2、  將血液與等量1640培養液混勻後，沿管壁漸漸加入到含有4ml淋巴細胞分離液的離心管中（混合血：淋巴細胞分離液=6：4），3000轉離心10分鐘。
3、  吸取白細胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養液6ml，輕輕混勻，進行第一次洗滌。1500轉離心15分鐘。
4、  棄上清液，再加6ml1640全培養液進行第二次洗滌，離心1500轉15分鐘。
5、  棄上清液，加入2ml1640全培養基（全培養基加入前，置37度水浴10分鐘），然後加入環胞黴素A（4%）和1.2mlEBV液/份，充分混勻後移入到25平方釐米的培養瓶，置37度，5%CO2培養箱中。
6、  每2-3天加入3ml新鮮配製的培養基（1.6% 1M HEPES 緩衝液；15%胎牛血清（FBS）；1%青黴素和鏈黴素；PRMI 1640補足到100%）。7天左右鏡下觀察，可見淋巴細胞明顯增大，出現聚集現象。
7、  如果細胞增長慢，或細胞密度低，或培養液pH值呈酸性，吸出半量培養液，進行等量換液。

8、  當總量達到14ml時轉移到75ml培養瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養基。
9、  約6-8周，當總量達到45ml時，置50ml離心管中，離心1500轉，10分鐘。棄上清，加入3ml凍存培養基（5%二甲基亞楓(dimethyl sufoxide)，95%FBS）混勻，成細胞懸浮液。凍存管分裝，1ml/管，立即置零下80度，1-2小時後移入液氮罐中。

參考文獻：
1、  哈爾濱醫科大學學報，1997年8月，31卷第4期。
2、  美國斯坦福EBV轉染B細胞方法

本網站所有註明「來源：生物谷」或「來源：bioon」的文字、圖片和音視頻資料，版權均屬於生物谷網站所有。非經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任。取得書面授權轉載時，須註明「來源：生物谷」。其它來源的文章系轉載文章，本網所有轉載文章系出於傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與

我們聯繫

，我們將立即進行刪除處理。

溫馨提示：87%用戶都在

生物谷APP

上閱讀，掃描立刻下載! 天天精彩！