也許大概7年前，當導師告訴我要對我所研究的Xxoa蛋白做一些定點突變時，我的內心是拒(bu)絕(gan)的：第一次進行這種大實驗，你不能讓我做，我就馬上開始做。第一我要研究一下原理，方法啊，因為我不願意什麼都不懂就開始一頓忙操作，到頭來結果很壞，師兄師姐一定會覺得我很蠢，研究生剛進實驗室，第一次還是要給他們眼前一亮的感覺！其次呢，做實驗前總要準備試劑，還有各種材料，兵馬未動，糧草先行。
於是得先請教一下師兄師姐們：咱們有什麼試劑？你們之前是怎麼做的？
師姐A:一年多前啦，好像用的是一個試劑盒。
師姐B:這個實驗我們也不常做啊，試劑盒內的高保真酶可能用完了。
師兄D：那個Dpn I還有，你再買一管Herculase酶吧
master p：河什麼絲，師兄？
師兄D在一張草稿紙上飛速寫下「Herculase」,然後說：喏，河口蕾絲，這是比Pfu還牛B的高保真聚合酶，趕緊買一個去吧！
幾通電話後，輾轉聯繫到了北京一家公司才算購買到。Agilent是外國大牌，整個天津城都找不到貨——還是帝都這樣的一線大城市好哎。
自那以後，Master P再也沒用過那款"河口蕾絲"的酶（主要是沒需求，沒途徑），但是已經在定點突變實驗上小有經驗。現在就跟隨小P來了解一下定點突變的原理與方法吧！
體外誘變有多種方法，這篇主要介紹初學者最容易入門的以環形質粒做模板，並通過Dpn I消化原始模板質粒DNA的方法。
原理：
（以下藍色字體引自《分子克隆實驗室指南·第四版》相關章節）
以雙鏈DNA為模板的體外誘變：用Dpn I選擇突變體
以變性質粒DNA作為模板，在高保真聚合酶作用下，使用兩條寡核苷酸鏈引導DNA合成。兩條寡核苷酸鏈內均含有預定突變位點，並且兩者在質粒DNA上的結合形成彼此反省互補。在該方案中，經過多輪熱循環，雙鏈質粒DNA的全長均以線性形式擴增，最終產生一種DNA雙鏈帶交錯缺口的突變質粒。
圖1 環形質粒法定點突變示意圖
圖片來源於Agilent Quickchange定點突變試劑盒。如圖所示，黃綠所示為作為模板的質粒DNA,來源於大腸桿菌；紅藍所示為經過高保真酶擴增而得到的具有nick(缺口，DNA鏈的磷酸二酯鍵並未閉合，此類質粒應歸類於開放式-環形質粒，拓撲結構與閉合環形質粒有差異。通常，普通教科書內講述大腸桿菌轉化質粒的時候，質粒閉合環形，如從某個菌株提取的質粒，或者經過限制酶切後有經連接酶（T4 DNA ligase 或者Taq DNA ligase）構建而成的質粒。非閉合環形質粒同樣也能被大腸桿菌細胞吸收收，斷裂的nick可在質粒進入感受態細胞內後被修補。
因為擴增反應使用一定量的模板DNA,野生型質粒DNA的轉化子背景將非常高，因此需要增加富集突變體DNA的步驟。該方案通過採用可以特異性消化完全甲基化（5´-Gm6ATC-3´,Vovis and Lacks 1977）的限制酶Dpn I處理線性擴增產物來實現這一目標。Dpn I可以消化擴增反應體系中的來自大腸桿菌的模板DNA,對於擴增產生的DNA則不能消化。未被消化的突變開環質粒DNA可通過轉化並篩選帶有抗生素抗性的大腸桿菌，最終獲得的是還有預突變位點的完整的突變體質粒（在大腸桿菌內複製，提取質粒獲得）。根據誘變體的複雜程度和模板長度不同，最終將有15-80%的轉化子含有所需要突變的質粒（Weiner,1994）
該方法成功的關鍵在於引物的設計和選擇恰當的熱穩定DNA聚合酶，這在該方案的討論部分會有進一步的論述。
實驗流程：
將1-10ug質粒DNA溶於40ul H2O中，再加入10 ul 1M NaOH/1mM ETDA溶液。37℃孵育15 min 變性質粒模板。
加入 5 ul 3 M NaAC，pH4.8.再加入150 ul預冷的乙醇沉澱DNA.
4℃ 離心10min 收集變性的質粒DNA。小心棄去乙醇上清。再次乙醇沉澱，之後重新懸浮DNA於 20 ul水中。
配置一下體系
10× Reaction Buffer 5 ul
模板質粒DNA 5-50ng
Forward Primer(20 mM) 2.5 ul
Reverse Primer (20 mM) 2.5 ul
dNTP 2.5 ul
Pfu 2.5 U
補水至 50 ul
5. 上PCR儀進行反應。單鹼基置換：12個循環，一個胺基酸置換：16個循環，插入或者缺失：18個循環。
6. 擴增完成後電泳檢測。
7. 直接加入10 U Dpn I到5反應擴增產物內，37℃ 反應1h.
8. 轉化大腸桿菌感受態。
9. 挑去數個菌落，培養管培養提取質粒，質粒送一代測序，或者PCR擴增送產物測序。
備註：以上為實驗的大致步驟。MasterP根據相關實驗內容進行一定幅度的簡化描述。但保留必要的步驟，仍可以作為實驗參考。
關於1-3步驟：理論上，在質粒DNA 用作PCR模板前不需要變性。如果省略鹼變性步驟，超螺旋的天然雙鏈DNA也可以在PCR過程的加熱至94℃而變性。
鹼變性的好處是：質粒DNA在鹼溶液中持續變性後會形成特定的狀態，這種形式的質粒DNA可以作為模板，但是沒有民概念的轉化細菌的能力。因此，包含非變異的野生型DNA克隆的背景將明顯減少（Du et al,1995;Dorrell et al，1996）相對應地，在聚合酶鏈反應的變性步驟可打亂鹼基配對，但並不會破壞質粒分子轉化的能力，因此轉化後的克隆含有比例較高的非變異的親本質粒分子。在實驗的最後階段，當需要從克隆中篩選出含有突變的DNA時，鹼變性的優勢便會體現出來。
如果誘變效率低且所選的Dpn I無效，含有野生型分子的克隆比例可能會異常高。
關於10× Reaction Buffer:因為要擴增一個完整的質粒，長度要比一般的PCR擴增要長，這要求反應緩衝液要適應長片段擴增，pH要高於普通PCR所用Buffer。
關於高保真DNA聚合酶：Pfu的保真度足夠，但如今市面上有更好，擴增更快速的高保真DNA聚合酶可用。如果是購買了定點突變試劑盒，使用配套的聚合酶就足夠了。
關於PCR循環次數：所有實驗儘量不超過20個循環，這是為了保持較低的拷貝數，同時，PCR的後期（20個循環以後的循環內）更容易產生突變，較少的循環數也有利於保真度，出現非預設突變的概率也較低。
關於誘變效率低的實驗應用：在步驟7前，需要對擴增產物進行酚氯仿抽提，乙醇沉澱。但是如今一般實驗室較少使用酚氯仿這類試劑，實驗室使用商品化的PCR產物純化試劑盒也能完成這一步的產物純化工作。隨後，進行磷酸化，再用連接酶處理。這樣的操作是將帶nick的開環質粒在分子內而不是分子間環化，更有利於大腸桿菌轉化。
關於最終測序驗證：測序驗證不可少，這一步沒必要為節約測序費用而省略。以Master P個人經驗，挑去3-5個菌落，培養後提取質粒，測序就足夠挑到含目的突變點的突變質粒了。
實驗材料準備：
一般分子生物學實驗室，大多能夠完成PCR/電泳/膠回收/轉化/細菌培養，所以對常規試劑與儀器將不再列表。
對於有錢的土豪，Master P自然要列出Bigger Than Bigger的試劑,全是大牌進口：如Agilent 公司的Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit,New England Biolabs公司的Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit,ThermoFisher公司的Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit或者GeneArt Site-Directed Mutagenesis System等。這些試劑盒無疑都是比較優秀的產品，使用起來方便，所需試劑如dNTP，Dpn I，感受態細胞，甚至SOC培養基都配備齊全。如下圖中QuickChange試劑盒的物品清單，便可見Master P所言不假。
圖2 QuickChange 突變試劑盒組分清單（取自對應產品說明書）
在此，Master P給出實驗所需的高低配置，是不是很像組裝電腦配置單？
土豪至尊版配置是這樣的：
中產舒適版配置是這樣的：
小康宜家版配置是這樣的：
溫飽掙扎（大神）版配置是這樣的：
關於各個版本說明：
Master P發現，任何行業都存在省力氣（時間）費錢這麼個道理：比如點外賣比自己做飯貴，打車比步行去某地要貴，在網上花錢購買資料貴比辛苦搜尋貴。可見時間就是金錢。人的財富是我們的時間和勞動力，再次印證了亞當斯密誠不欺我也！
使用試劑盒來完成實驗固然輕鬆，但是也有其弊端。在Master P還是學生時期，就不太明白簡單如質粒提取試劑盒內各個成分的作用，只知按照說明書無腦一頓操作就能提取到自己想要的質粒。這弱化學習實驗原理的動力與機會。
窮人的孩子早當家，沒錢的實驗室，做實驗只能更多的DIY了：試劑都由自己純手共打造。
那麼，為什麼定點突變的乞丐（大神）僅僅用一個高保真DNA聚合酶，而不用Dpn I也能完成呢？
原因就在Dpn I只是一個控制原始質粒的手段，而非必不可少。
關鍵點在控制量：一是使用模板的量，雖然5ng的質粒DNA是一個理想的模板濃度，但是低至0.1ng的模板DNA也是可以擴增出來的；這就弱化了Dpn I消化的必要性。二是可以犧牲一點點保真度的考量，增加幾個循環以使擴增產物相對模板量比例更高一點。三是可以挑取5個轉化子，按照概率算，只要前兩步關鍵點控制好，肯定得到至少一個正確突變點。這就足夠了，誰讓我們窮吶！
當然，如果不嫌麻煩，提前對模板做個鹼變性，也是能提高效率，降低背景的。
引物設計原則
一對寡核苷酸引物：
當引入點突變時，一個引物帶有野生型序列，而另一條引物含有所需的突變，並且在突變位置的兩側都至少含有12個鹼基的正確序列。如果產生缺失突變，兩個引物都含有野生型序列，但它們的間距在模板上的距離與缺失片段的長度相關。產生插入突變的話，需要一個引物包含的野生型序列而另一個引物的5`端含有需要插入片段的序列。
這段關於分子克隆四版關於引物設計的原封抄寫，個人感覺有一半含混不清。不知道美國作者的錯，還是軍科院研究生翻譯水平的偏差？話說整體來看，第四版中文版錯誤的地方還真不少，很多翻譯的原因，難道真如Master P的導師所針砭的，90年代的研究生，00年代的研究生和10年代的研究生，一代不如一代？
不能太教條，盡信書不如無書，即使是分子生物學中的Bible級別的工具書。事實上，任何人也都不可能在所有方面成為專家。且不說一代不如一代這樣的問題，現在讀研的學生越來越多，大有「人均研究生」的趨勢，那麼治學嚴謹的研究生所佔比例，究竟是低了？
即便是Agilent公司，也沒有徹底修改自己的引物設計原則。Lei Zheng等（2004）報導了一種部分重疊的突變引物設計原則，效果不錯。QuickChange有一版說明書引用了這篇，但是仍沒有作為主流方法。
圖3 Partial Overlapping 引物設計方法示意圖
與標準QuickChange 設計方法相比，兩對引物非完全互補的Partial Overlapping設計方法有以下幾個好處：
Tm不再是不得不考慮的因素，更廣泛的鹼基序列可被用到序列設計區域
可以跨越更寬的序列區域。
突變位點可離5`端4bp，離3`端6-8bp,而標準QC設計是要放在離兩端10-15bp的中間。
一條引物可包含更多突變鹼基，最高達17.5%的突變鹼基佔比，這一特點對需要考慮中性突變的應用更加有用。
Overlapping設計的一些原則：
3`端非重疊區域包含至少8bp
目標突變點序列應包含在上下遊序列內，中性突變應至少包含在一條引物內。
引物末端至少1個G或者C鹼基。
也許，從善如流真的很難做到。有需求的可以下載此篇看看，NAR的文章基本都是免費的。
圖4 Lei Zheng關於定點突變的文獻
聚合酶酶選擇：
應滿足三個基本需求：1.校對活性高；2.鹼基錯配率低；3.缺乏非模板末端轉移酶活性
MasterP發現，中文的《分子克隆實驗室指南》確實不能深究，以上3個特點讓人迷惑，校對活性是保真度所依賴的活性，而保真度高自然錯配率低，所以1和2嚴格來說就是一個特點呀！第三點就是不依賴模板的末端轉移酶（Terminal transferase，TdT）活性，翻譯為「非模板末端轉移酶活性」是不妥的，這個研究生應該出來挨打。當然還有別的例子，翻譯人員理解程度，或者嚴謹性決定了翻譯質量。
MasterP一言以蔽之：不要用Taq DNA聚合酶，選一個能擴增長片段的高保真DNA聚合酶就完事了！
引物設計實例：
需要定點突變的實驗，大多數是胺基酸定點突變，還有一些是基因調控序列（UP element,啟動子序列，或者轉錄起始區域）的突變研究。
儘管生物學發展到9102年了，但是蛋白質單點胺基酸突變還是研究某個點對蛋白質整體摺疊與穩定性或活性關鍵位點的有用方法，即使知道了野生型酶的三維結構，仍無法準確回答某位點的改變對酶整體的影響變化。
一個突出的典型的例子是Tabor和Richardson（1990）對T7 DNA聚合酶活性位點的研究，這一成果帶來了用於熱循環測序所用的Taq DNA聚合酶開發。
下面Master P將列出兩張圖以揭示兩種不同引物設計的直觀差別
圖5 經典的QuickChange定點突變引物設計
圖6 Overlapping定點突變引物設計
個人傾向於第二種設計方式，因為上下遊引物不會完全互補，退火受到影響更小，如果感興趣可以結合引物設計的基本理論在腦海裡模擬這個退火延伸的過程。
以上是關於以環形質粒做定點突變方法的主要內容。希望能給初學者帶來指導性的方法，也希望能為行業老兵帶來新的思考角度。可惜個人訂閱號關注者還太少，離可開通評論功能還差的有點遠。Master P還會努力的。
2019-4-29
利益衝突聲明
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2019-4-29
參考文獻
1.M.R.格林，J.薩姆布魯克.體外誘變方法，《分子克隆實驗室指南》第四版中文版，2017，科學出版社
2.Vovis GF，et al.Complementary action fo restriction enzymes endo R-Dpn I and R-DpnII on bacteriophage f1 DNA.J Mol Biol 115:525-538
3.Weiner,M P，et al.Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by thepolymerase chain reaction.Gene 151:119-123
4.Du Z，et al.Improved recombinant PCR mutagenesis procedure that usesalkaline-denatured plasmid template.Biotechniques 18:376-378
5.Dorrell N,et al.Improved efficiency of inverse PCRmutagenesis.Biotechniques 21：604-608
6. QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit Instruction manual,Version E.0，Agilent
7.Lei Z,et al. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesisprotocol.Nucleic Acid Research,2004,32:e115