我們對新冠病毒變異還是太大意了！
4月19日，李蘭娟團隊在預印本平臺medRxiv上發表了最新研究成果，研究者分析了11份新冠患者分離毒株的突變特徵，找到19個首次發現的新突變。值得注意的是，這些毒株在體外實驗中表現出了非常大的致病性差異，不同毒株24小時病毒載量差最高達270倍！
這是新冠病毒突變影響病毒致病性的首個直接證據。
論文的四位通訊作者分別為中國工程院院士李蘭娟，浙江大學生命科學研究院研究員蔣超，浙江大學醫學院附屬第一醫院教授吳南屏、鄭敏。
我們知道，新冠病毒進入宿主細胞主要依賴S蛋白，其中受體結合域（RBD）部分是基因突變發生最頻繁的部分。
截止今日上午，新冠病毒已經在全球範圍內導致超過240萬確診病例，死亡人數超過17萬。在如此大規模的傳播中，新冠病毒產生的突變是否已經對致病性產生本質上的影響了呢？了解這個問題，是指導藥物和疫苗開發戰略的關鍵一步。
為了解決這個問題，研究者們分析了來自真實新冠患者的病毒毒株。
研究涉及的11例新冠患者是浙大附一於2020年1月22日至2020年2月4日期間、疫情爆發早期收治的。11例患者中，5例確診前在武漢工作或曾到訪武漢，5例與武漢人員有密切接觸，1例與新冠確診人員有接觸。4號、5號、9號患者曾與武漢同事出席同一個會議。
從流行病學角度，這11例患者已經構成了一代和二代感染病例。
11例患者中男性8人、女性3人，年齡從4個月至71歲不等。10例患者為中度及以上症狀，3例有合併症，1例進行了ICU治療。截止論文撰寫，所有病人均已康復。
11例患者的詳細特徵
通過Illumina Novasq 6000平臺對從這11例患者中分離出的毒株進行超深度測序，平均每個樣本產生67.16Gb數據，過濾後得到245M的reads。研究者總共找到了33個突變，對比3月24日在GISAID發布的111個序列，其中19個突變是新的突變。
1號毒株中發現的兩個突變（G11083T、G26144T）被認為是同一病毒大群的始祖突變，2號毒株和8號毒株中發現的兩個突變（C8782T、T28144C）被認為另一病毒大群的始祖突變。
2、5、9、10、11號毒株中均發現的T22303G，此前僅在澳大利亞分離到的病毒株中有鑑定。與5、9參與同一會議的4號患者分離毒株存在一個新的突變A22301C，它在蛋白水平上導致與T22303G同樣的錯義突變。
11號毒株在ORF7B基因中有4個突變，其中3個連續，並導致2個蛋白錯義突變。研究者認為這個三核苷酸突變是具有重要意義的，該毒株在之後的實驗中表現出了極強的致病性，同時，11號患者也在臨床上表現為罕見的持續45天核酸陽性。
雖然只檢測了11株病毒，但從數據中我們可以看出，新冠病毒的多樣性是非常豐富的。而且考慮到取樣時間較早，但33個突變中19個是新突變的事實，我們對病毒多樣性的認識還遠遠不足。
另外，11個毒株中，有三個取自糞便樣本，這與之前報導糞便中不存在活病毒是完全相反的，新冠病毒可以在糞便中複製。
11個毒株的主要突變特徵，藍色為本次研究發現的新突變
為了解這11個毒株在進化上的背景，研究者從GISAID獲取了725個新冠病毒基因組，來源於蝙蝠的RaTG13毒株和廣東穿山甲毒株作為外群。共計736個病毒序列構建的系統發育樹與目前GISAID更新的分析基本一致。
在發育樹中可以觀察到很多始祖突變，並表現出明顯的地理模式，尤其是歐洲和美國。
將11個毒株整合進發育樹，從圖中可以看到，1號毒株所屬的類群同時具有兩種突變（G11083T、G26144T），該類群毒株大部分採集自荷蘭和英國；2、8號毒株所屬的類群具有兩個同樣的突變（C8782T、T28144C），該類群內存在來自美國西雅圖的單源亞支；如前文所述，9、11號毒株由於T22303G與澳大利亞的分離株聚類。除此之外，其他毒株並不與已知的大規模病毒群聚類。
研究者認為，病毒群表現出的明顯地理模式可能是由於大流行初期病毒突變的始祖效應。
發育樹
那麼基因突變到底會對病毒致病性造成什麼樣的影響？
由於臨床上患者的病情受到個體年齡、共病等多種因素的影響，所以儘管已經有很多關於新冠病毒突變的研究，但我們至今還沒有突變與病毒功能改變之間的直接證據。
為此，研究者進行了體外感染實驗，選取的對象是Vero-E6細胞（猴腎細胞）。Vero-E6細胞雖然不是人類細胞，但是該細胞的ACE2蛋白與人類ACE2蛋白高度相似，實驗中也可以被新冠病毒感染。
可觀察到冠狀病毒感染的「王冠」
研究者分別用11個毒株感染Vero-E6細胞，並在感染後1、2、4、8、24、48小時收集細胞，通過RT-PCR來檢測循環閾值（Ct），Ct值越低表示病毒載量越高；同時在48小時和72小時時採用DIC顯微鏡觀察細胞病理效應（CPE）。
在病毒入侵細胞的早期階段，病毒複製較少，感染後1、2、4小時Ct值基本平穩；感染後8小時，6、7、9、10、11號毒株的病毒載量明顯增加；感染後24小時，除了2、7號毒株，所有毒株病毒載量均顯著上升，尤其10、11號毒株，載量增加明顯快得多。
值得注意的是，不同類群毒株之間病毒載量的變化差異非常大。前文所提同屬一個類群的2、8號毒株在感染後24小時病毒載量明顯更低，另一類群的1號毒株載量則是它們的19倍。此外，感染後24小時，10號毒株與2號毒株的病毒載量相差近270倍。
研究者認為，這些差異是由新冠病毒基因組突變導致的。
RT-PCR分別以ORF1a、E、N基因為靶基因
結果高度一致，故只討論ORF1a
顯微鏡下觀察結果顯示新冠病毒的細胞病理效應和病毒載量是高度一致的，也就是說病毒載量越高，該毒株導致的細胞死亡率就越高。
該研究顯示，新冠病毒存在大量的單核苷酸變異，而且與病毒致病性直接相關。在新冠疫情已經大流行的此刻，疫苗和藥物的研發必須要考慮到這些突變的影響。
註：該論文發表於預印本平臺，未經同行評審，不應用於指導臨床實踐。
編輯神叨叨
由奇點糕歷時3個月打造的音頻課程《小細胞肺癌8講》重磅上線啦～ 我們用8講的課程，幫您回顧了小細胞肺癌領域近30年來的重要探索和進展。只需80分鐘，即可縱覽小細胞肺癌領域的前沿學術進展。
長按識別下圖中的二維碼，即可購買這套超值的音頻課程。認證用戶，僅需9.9元！
此外，我們還準備了少量紙質版講義，購買課程後加主編微信即可免費申領，先到先得！
參考資料：
[1]https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.14.20060160v1
點擊播放 GIF 0.0M
本文作者 | 代絲雨