責編丨迦漵
自然界中種類繁多，形態各異的植物產生了大量結構複雜多樣的天然產物（或者稱為次生代謝產物）。這些天然產物既可以作為內源性小分子參與植物重要生理活動，例如調控植物自身的生長發育（例如赤黴素、脫落酸等植物激素）以及抵禦病蟲害（例如豌豆素、白藜蘆醇等植保素）， 同時也是治療人類重大疾病的創新藥物分子的主要來源，例如：嗎啡、阿司匹林、紫杉醇，喜樹鹼、青蒿素等。因此，解析植物天然產物的生物合成途徑對於植物生物學研究、生態學研究、以及開發創新藥物治療人類重大疾病和植物保護分子都具有重要意義。
與微生物相比，研究植物天然產物生物合成途徑存在著更大的挑戰。首先，植物基因組龐大，遺傳背景複雜，難以獲取高質量基因組序列。其次，植物天然產物生物合成基因大多數情況下並不成簇分布在植物基因組中，無法利用微生物天然產物生物合成研究中常用的基因簇挖掘（「genome mining」）的方法來鑑定植物天然產物生物合成途徑。最後，植物，特別是非模式植物，生長周期較長，遺傳操作相對複雜，很難通過體內敲除直接驗證基因功能。目前，在植物天然產物生物合成研究中的方法十分有限，包括了轉錄組分析、活性導向蛋白分離以及基於同源性的反向遺傳學研究，如圖1所示。但這幾種方法也有自身的一定局限性，不能有效促進植物中全新功能蛋白的發現，因此，開發出新穎的研究方法對於植物天然產物生物合成來說具有重要意義。
圖1 微生物來源與植物來源天然產物生物合成研究方法比較
2020年5月25日，北京大學化學與分子工程學院雷曉光課題組、中國醫學科學院藥物研究所戴均貴課題組以及中國中醫科學院黃璐琦課題組合作，在Nature Chemistry雜誌上發表以FAD-dependent enzyme-catalysed intermolecular [4+2] cycloaddition in natural product biosynthesis為標題的文章，解析了來源於傳統中藥桑白皮中的活性天然產物生物合成關鍵步驟，發現了自然界中存在的首例催化分子間Diels-Alder反應的單功能酶。該工作還發展了一類新穎的、基於「天然產物生物合成中間體分子探針」的化學生物學策略，為解析植物天然產物生物合成途徑提供了新的研究思路。
在本文中，作者開發出一種基於天然生物合成中間體分子探針（Biosynthetic Intermediate Probes， BIPs）的靶標垂釣策略，並結合活性導向蛋白分離以及轉錄組測序等方法，成功在桑樹愈傷組織中鑑定出兩個FAD依賴蛋白（MaMO和MaDA），其中MaDA為從自然界中發現的首個催化分子間Diels-Alder反應的單功能酶。
桑科植物的根皮是一種傳統的中藥——桑白皮，它具有止咳、平喘、抗炎等功效。於此同時，現代醫藥學研究發現，桑白皮具有抗HIV的功效，其作為「複方SH」的主要有效成分已被泰國政府批准用於治療愛滋病。桑白皮中含有一類特殊的Diels-Alder（D-A）類型加合物，這類天然產物具有共同的環己烯骨架結構，且具有多樣的生物活性，包括抗氧化，抗菌，抗病毒，以及潛在的治療糖尿病的功效（J. Asian Nat. Prod. Res.2014, 16, 690–702.）。生源上，這類天然產物是由查爾酮（親二烯體）和不同二烯體發生分子間Diels-Alder反應形成的，如圖2a/b所示（J. Chem. Soc. Chem. Commun.1990, 8, 610-613）。
微生物來源的 D-A 反應酶雖然已屢見不鮮，但到目前為止，植物來源的 D-A 反應酶還鮮有報導。目前，tabersonine synthase(TS)是唯一已知的催化分子內D-A反應的植物來源的D-A反應酶。另外，除了Macrophomate synthase和Riboflavin synthase以及近期協和藥物所的胡友財課題組報導了催化分子間雜D-A反應的EupfF（J. Am. Chem. Soc.2019, 141, 14052-14056）外，目前已知的D-A反應酶絕大部分催化的是分子內的Diels-Alder反應，因此，揭示桑樹中全新的分子間Diels-Alder 反應酶，不僅會極大地豐富我們對D-A反應酶的認知，也會促進桑科植物中這類具有重要生物活性得D-A類型天然產物的開發和利用。
為了找尋桑樹愈傷組織中催化morachalcone A（2）和二烯體（4）發生分子間D-A反應的酶，作者提出了一種基於天然生物合成中間體探針（Biosynthetic Intermediate Probes, BIPs）的靶點垂釣研究策略，如圖2c所示。通過對細胞裂解液的分離純化，研究人員可以提高目標蛋白的含量，降低假陰性結果的可能性；同時通過分離純化，去除掉體系中的幹擾蛋白，降低假陽性結果的可能性。基於生物合成中間體探針的靶點垂釣可以與轉錄組分析以及活性導向蛋白分離等方法形成優勢互補，從蛋白和底物有結合的角度為研究植物天然產物生物合成途徑提供新的思路。
圖2 桑樹中D-A類型天然產物可能的生物合成途徑以及基於生物合成中間體探針的靶點垂釣
為了合理設計和合成BIPs，作者對親二烯體morachalcone A（2）進行了SAR研究（圖3a/b），併合成了探針分子8。隨後，作者將該生物合成前體探針分子8與分子篩純化後高活性組分孵育並進行紫外交聯，然後進行後續的「pull-down」實驗，最後通過銀染找到了可能與探針分子存在相互作用的蛋白，如圖3c中紅色箭頭所示。LC-MS/MS數據顯示，在該條帶中包含了BBE-like proteins，這暗示著桑樹中的BBE-like protein很可能是D-A反應酶。
圖3 利用基於生物合成中間體探針的靶點垂釣測策略探索純化後高活性組分中的靶點蛋白
在前期的基於活性導向的蛋白分離的實驗中，作者證明了桑樹中BBE like protein參與二烯體4的形成，而通過靶點垂釣實驗也暗示著桑樹中某些BBE-like proteins催化了分子間的D-A反應，於是作者對桑樹愈傷組織進行了轉錄組測序，共鑑定出了14個BBE-like protein家族蛋白，並對轉錄水平最高的兩個基因（MaMO和MaDA）進行了表達純化以及功能驗證。酶學活性測試發現，MaMO能夠氧化moracin C（3）生成二烯體（4），而MaDA卻不能。MaDA能夠催化二烯體（4）和morachalcone A（2）發生分子間[4+2]環化反應，而MaMO在同樣條件下卻不能催化該反應的發生。這說明MaDA是首個催化分子間[4+2] 環化反應的單功能酶。此外，作者還對這兩個酶的酶學性質進行了表徵，如圖4所示。
圖4 MaMO和MaDA的活性檢測和酶學常數測定。a), i）標準化合物3，ii）標準化合物4，iii）化合物3與MaMO，iv）化合物3與緩衝液； b), i）標準化合物4，ii）標準化合物2，iii）標準化合物1，iv）化合物2和4與MaDA，v）化合物2和4與緩衝液； c），MaMO底物（3）的動力學分析； d），MaDA底物（2）的動力學分析。
隨後作者探究了MaDA的底物適應性。作者發現，不同的morachalcone A的衍生物（5-7）及其類似物（15，16）均能被MaDA識別，但去掉異戊烯基後的化合物14不能被識別。另外，化合物6和16的轉化率也顯著降低，如圖5a所示。這些結果暗示著morachalcone A（2）中的異戊烯基以及2和2』號位上的羥基可能與MaDA有較強的相互作用。作者也合成了五種不同的二烯體，利用MaDA催化的endo專一性的D-A反應，實現了包括chalcomoracin在內的多個天然產物及其類似物的首次不對稱全合成，如圖5b所示。
這些實驗結果表明，作為一個催化分子間Diels-Alder反應的酶，MaDA對二烯體和親二烯體都具有很好的底物兼容性，可作為一種高效的生物催化劑，用於D-A類型化合物的合成。同時，這些結果也揭示了桑樹中endoD-A類型天然產物結構的多樣性可能來自於MaDA底物的寬泛性。
圖5 MaDA底物適用性的探究
為了探究該分子間[4+2]反應的機理，作者首先對非酶促的分子間[4+2]反應進行了DFT機理計算。DFT計算表明，endo產物過渡態比exo產物過渡態在能量上低2.8–3.0 kcal mol–1，如圖6a所示，這解釋了為什麼該反應展現出endo選擇性。在endo產物過渡態中，將要形成的兩根C-C鍵分別為2.03 and 2.69 （圖6a），這說明該環化反應可能是通過協同但不同步的反應機理進行的（concerted but asynchronous reaction）。作者還測定了酶促反應中二烯體10上不同位置的KIE數值（圖6b），其實驗結果也支持MaDA催化的[4+2] 環化反應是一個協同但不同步的Diels-Alder反應。這些數據支持MaDA是一個真正意義上的分子間Diels-Alder反應酶。
圖6 DFT計算（a）以及KIE測定（b）
為了進一步探索MaDA的催化機制，作者成功解析了MaDA的晶體結構（2.3 ），如圖7a所示。通過將產物chalcomoracin (1)對接進MaDA的口袋中發現，F356、N357、 L358、 L373、N374和F375可能與二烯體（4）有相互作用，而V177、I259、F292、Y192 和 R443可能與親二烯體morachalcone A（2）有相互作用，如圖7b所示。基於此，作者將可能與產物形成相互作用的胺基酸進行了突變，結果顯示，F375，R443，F356 I259以及Y192對於維持MaDA的活性至關重要（圖7c）；同時，作者還發現氧化態的FAD對於MaDA的活性也非常重要，如圖7c所示。
圖7 基於MaDA晶體結構的分子對接以及點突變實驗揭示了MaDA與底物形成相互作用的關鍵位點
綜上所述，研究者通過活性導向蛋白分離，基於生物合成中間體探針（biosynthetic intermediate probes, BIPs）的靶點垂釣和轉錄組分析相結合的策略成功在桑樹愈傷組織中鑑定了兩個FAD依賴的蛋白， MaMO和MaDA。其中，MaDA為首例催化分子間[4+2]環化反應的單功能酶。作者通過DFT以及KIE實驗證明了該酶促反應為協同但不同步的Diels-Alder反應，因此MaDA是首個從自然界中發現的、催化分子間反應的Diels-Alder反應酶，從而結束了學術界一直存在的「自然界是否有真正意義DA反應酶」的爭論。
作者還成功解析了MaDA的晶體結構，並初步闡明了底物和蛋白相互作用的機制。此外，MaDA有很好的底物寬泛性，利用MaDA實現了多種D-A類型天然產物的酶法合成。該酶法合成展現出普通化學方法難以實現的高效性與立體化學專一性，體現了MaDA在生物催化中的優勢和特點，為發展酶催化合成方法來高效製備結構多樣的功能有機分子開闢了新的研究方向。此外，本研究所提出的基於天然產物生物合成中間體分子探針（BIPs）靶點發現的化學生物學研究手段也會為闡明天然產物生物合成途徑、發現新穎的生物合成酶提供新的研究方法與思路。最後，該類藥用植物來源天然產物生物合成途徑的解析也為後繼合成途徑重建，實現植物天然產物的微生物異源生物合成，並開展結構衍生化研究，提升功能活性鋪平了道路。
在本工作中，雷曉光課題組高磊博士，戴均貴課題組蘇聰博士，雷曉光課題組杜曉霞博士以及黃璐琦課題組王瑞杉博士為共同第一作者。北京大學雷曉光教授，中國醫學科學院藥物研究所戴均貴研究員以及中國中醫研究院黃璐琦研究員為共同通訊作者。北京生命科學研究所的周宇博士和黃牛研究員以及UCLA的Chen Shuming博士和K. N. Houk教授在計算模擬，DFT計算方面做出了重要貢獻。此外，北京生命科學研究所的陳涉研究員，中國中醫科學院的郭蘭萍研究員，北海道大學的Oikawa教授，Minami副教授以及劉成偉助理教授，以及帝京平成大學的Hano教授和Shimazaki教授也在質譜分析，轉錄組分析以及酶活測試等方面提供了重要幫助。