大家好，今天與大家分享一篇2020年發表在Chem. Sci.上的文章Use of an asparaginyl endopeptidase for chemoenzymatic peptide and protein labeling，通訊作者是來自卡迪夫大學化學學院Louis Y. P. Luk教授.
從植物分離出的天冬醯胺基內肽酶（AEP）具有轉肽酶功能，是一種用於蛋白標記的理想生物催化劑。AEP水解C端的天冬醯胺或天冬醯胺殘基的肽鍵，接著催化連接N端親核的多肽。醯胺鍵OaAEP1是一種重要的AEP酶，最大的特點在於其出色的動力學特性和相對較短的識別序列（3個胺基酸，P1-P1』-P2』）。AEP酶廣泛用於蛋白標記，類似其他轉肽酶，通過AEP連接需要相對蛋白大大過量的標記物來實現反應的進行。研究表明，OaAEP1（C247A）可以識別Asn-Cys-Leu進行連接,但是反應將生成N端半胱氨酸（Cys-Leu）的副產物，而且產物具有一定的反應活性。2-甲醯基苯基硼酸（FPBA）是一種親電子試劑，可與N端的半胱氨酸反應，具有很好的選擇性和效率。FPBA及其衍生物可以用於多肽的標記。基於此，作者開發了化學和酶法聯用的蛋白標記方法，即AEP和FPBA聯用，通過AEP催化的分子間連接以及FPBA與反應副產物反應來實現蛋白質的標記。其中，AEP標記的P1-P1』-P2』識別序列為Asn-Cys-Leu，而FPBA作為清除劑，它與生成的產物Cys-Leu的1,2-氨基硫醇基序反應，可以進一步推動AEP催化的多肽連接，同時也減少標記試劑的使用量（圖1）。
圖1
為表明OaAEP1底物催化能力，作者做了20種胺基酸的對比，連接反應為CFRANXL（X是20種胺基酸的一種，50 mM）和GLGGIR（250 mM，5當量）在pH 5.0，0.1 mM酶濃度條件下（酶與底物的比例為1:500）（圖2A）。結果表明，OaAEP1可以水解天冬醯胺和除脯氨酸之外所有胺基酸之間的肽鍵。即OaAEP1可以水解Asn-Cys-Leu，而FPBA與生成的產物Cys-Leu的1,2-氨基硫醇基序反應。相比之下，P2』對胺基酸的要求更嚴格（圖2B）。作者使用的CFRANGX，OaAEP1更傾向於水解疏水性的胺基酸，如Phe，Ile，Leu，Met和Trp。2019年JACS報導的生成的NGV，OaAEP1水解NGV中天冬醯胺和甘氨酸之間的肽鍵能力差可以證實。基於前面的研究，P1』-P2』分別是G和L作為親核多肽，OaAEP1可以起到有很好的連接效果。
圖2
作者使用多肽LFRANCLK與GLGGIR連接反應作為模型，100個多肽反應探索pH值、反應時間、親核肽量以及FPBA等幾個關鍵因素對OaAEP1的水解反應影響。在最理想的條件下，即當反應體系中包含FPBA，使用1.2當量的親核肽，在pH 5.7，反應4小時，可以得到94％的連接產物LFRANGLGGIR。而當不加入FPBA時，產物的轉化率為約50％。對於無半胱氨酸的多肽LFRANALK，即使加入FPBA時也未觀察到連接產率的顯著差異。總之，實驗結果表明產率的增加是由FPBA反應和AEP催化連接之間的偶聯作用引起的（圖3）。
圖3
接著作者將新開發的AEP連接和FPBA偶聯的方法用於蛋白特定位置的C端標記。將包含Asn-Cys-Leu的linker添加到綠色螢光蛋白eGFP的C端，並與生物素化的多肽GLGGZ（其中Z為生物素化的賴氨酸）進行連接反應。LC-MS結果表明當加入FPBA時，C端修飾的蛋白質的產率提高1.5倍，並且當加入2當量的生物素多肽，C端修飾的蛋白質的產率可以達到92％（圖4）。類似的，作者也在beta-lactamase，AaLS13和ubiquitin蛋白的C端或者N端實現蛋白質標記（圖5）。
圖4
圖5
總之，作者提出OaAEP1酶連接和FPBA偶聯方法，該方法可以實現位點特異性標記蛋白質的N或C端，為製備特定的蛋白質構建提供了一種通用且有效的方法。
【本文作者】
馬群
鄭鵬課題組博士生
【原文連結】
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/d0sc02023k