平衡溶解度實驗基本程序和技術要求
來源
中國藥學雜誌 2019 年8 月第54 卷第16 期
微信編輯：凡默谷
作者
熊婧，張濤，許明哲，金少鴻
中國食品藥品檢定研究院
廣西壯族自治區食品藥品檢驗所
摘要
目的:
介紹平衡溶解度試驗的基本程序和技術要求，為科研人員對平衡溶解度試驗方案的設計和實施提供參考。
方法:
從溶解度的概念及影響因素、試驗的原理和測定方法、世界衛生組織( WHO) 平衡溶解度項目等方面進行闡述分析。
結果:
溶解度受緩衝液組成、溫度、振蕩時間、沉降時間、相分離方式等因素的影響。
結論:
確定藥物的BCS 分類首先要測定藥物在生理pH 條件下的平衡溶解度，平衡溶解度的測定沒有公認的標準方法，通過對WHO 推薦的平衡溶解度試驗程序的詳細闡述，幫助我國廣大醫藥工作者更好的實施平衡溶解度試驗，對規範其在BCS 分類和生物等效性豁免中的應用具有一定指導和借鑑意義。
關鍵詞
平衡溶解度; 搖瓶法; 生物藥劑學分類系統; 生物等效性豁免; 世界衛生組織
生物藥劑學分類系統( Biopharmaceutical classificationsystem，BCS) 是由Amidon 等［1］於1995 年提出的概念，根據藥物在水中的溶解度和腸壁滲透能力對藥物進行科學分類的標準。
美國食品藥品監督管理局( FDA ) ［2］、歐洲藥品管理局( EMA) ［3］、世界衛生組織( WHO) ［4］等監管機構分別出臺了基於BCS 豁免的指導原則，我國也於2016 年發布了《人體生物等效性試驗豁免指導原則》［5］，指出當滿足某些條件時，BCS 分類可作為判斷是否可以豁免體內生物等效性試驗的有力工具。
對於口服固體速釋製劑而言，決定藥物在體內吸收速率與程度的3 個主要因素分別是溶解性、腸壁滲透性和製劑的溶出度，根據溶解性和滲透性將藥物分為4 類。
應用BCS 對藥物進行分類時，為了保證分類的科學性，對藥物溶解性和滲透性的準確測定是首要前提［6］。
確定藥物的溶解性需要測定藥物在生理pH 條件下的平衡溶解度，迄今為止，測定平衡溶解度沒有公認的標準方法［2-7］。
由於實驗方法不同，對同一藥物不同文獻來源的數據可能存在差異，導致BCS 分類有差異。
例如治療系統研究實驗室( TSＲL) 發布舒必利為Ⅳ類低溶解性、低滲透性藥物，而查詢基於藥物體內處置的生物藥劑學分類系統( BDDCS) 其是Ⅲ類高溶解性、低代謝程度藥物; 再比如WHO 發布鹽酸氯丙嗪為Ⅲ類高溶解性、低滲透性藥物，而TSＲL 發布其為Ⅱ類低溶解性、高滲透性藥物，查詢BDDCS 分類則是Ⅰ類高溶解性、高代謝程度藥物。
溶解度受藥物的物化性質、介質的性質以及實驗參數等的影響，要獲得準確可靠的平衡溶解度數值是有難度的［8］，Edit 等［9］總結了發表的溶解度數值變異範圍大的例子，尤其膽固醇的變異範圍甚至超過了5 個數量級，為0. 025 ～ 2 600 μg·mL－1。
筆者介紹了平衡溶解度的概念及WHO平衡溶解度項目，詳細說明了平衡溶解度實驗的基本程序和技術要求，分析研究了影響溶解度測定的因素，旨在為科研人員對溶解度實驗方案的設計和實施提供參考，規範平衡溶解度實驗在BCS 分類和生物等效性豁免中的應用。
內容由凡默谷小編查閱文獻選取，排版與編輯為原創。如轉載，請尊重勞動成果，註明來源於凡默谷公眾號。
1
溶解度的概念
根據國際純粹與應用化學聯合會( IUPAC) 的定義，溶解度是飽和溶液在指定溶劑中以指定溶質的比例表示的分析組成。溶解度可以用不同的濃度單位表示，如質量摩爾濃度、摩爾分數、摩爾比、質量/體積比等。
溶解度通常分為3 種:
動力學溶解度，表示當溶液中剛開始出現沉澱時化合物的濃度;
平衡溶解度，也稱為熱力學溶解度，表示飽和溶液中存在過量固體時，溶液和固體處於平衡狀態時化合物的濃度，是固體溶解和從溶液中析出的動態平衡過程; 固有溶解度，是指離子型化合物在某個pH為完全非離子化的游離酸或游離鹼時的平衡溶解度。
根據一般溶解度方程( GSE) ，可以估算藥物在水中的固有溶解度( S) ( 公式1)
方程表明，具有較高熔點以及較高親油性化合物的水溶解性較低。
如果已知pKa，一般溶解度方程也可與Henderson-Hasselbalch 方程相結合來預測離子化合物的溶解度( 公式2) ［12］:
Stot為溶質總的溶解度，S0為固有溶解度，pKa 為酸解離常數的負對數，pKb 為鹼解離常數的負對數。
目前有幾種計算軟體可以用於估算基於結構的化合物油水分配係數和pKa 值，但不足以取代平衡溶解度實驗測定。
2
WHO 平衡溶解度項目
WHO 第40 次技術報告「關於豁免WHO 基本藥物目錄中口服固體速釋製劑體內生物等效性研究的要求」［4］一章的WHO 基本藥物目錄中，列出了基本藥物的溶解性、滲透性、BCS 分類及是否符合生物等效性豁免等。
WHO 期望將其不斷更新作為一個動態文件放在官方網站上。
2016 年WHO 藥品標準專家委員會( ECSPP) 達成了一致，該目錄應是基於驗證過的實驗室數據，而不是文獻數據。
因此2018年WHO 組織了一個新的多中心項目，全球十餘個國家實驗室和大學參加，目的是測定WHO 基本藥物目錄中原料藥的平衡溶解度，以確定藥物的BCS分類，判斷其是否可生物等效豁免。
筆者接下來對WHO 推薦的平衡溶解度實驗的基本程序和技術要求進行詳細闡述。
內容由凡默谷小編查閱文獻選取，排版與編輯為原創。如轉載，請尊重勞動成果，註明來源於凡默谷公眾號。
3
基本程序和技術要求
3. 1 基本原理
根據WHO 第51 次技術報告「多來源( 仿製) 藥品: 建立可互換性註冊要求的指導原則」［13］對溶解度的界定，當藥物的最高單次治療劑量在pH 1. 2 ～6. 8 內溶解於250 mL 或更少的水介質時，可視為高溶，其中最高單次治療劑量是由有關監管部門決定的，由批准的標籤或藥品說明書推薦。
藥物的pH-溶解度曲線應在( 37 ± 1) ℃水介質中測定，每個pH條件下至少重複測定3 次。
一般採用平衡溶解度實驗判斷藥物的溶解性，藥物首先溶解或懸浮在緩衝液中，用適當的方法分離之後，測定溶液或上清液的濃度。
測定前應記錄藥物的來源和純度，有時也需要了解其他特性。
實驗是在250 mL 體積中檢測最高單次治療劑量，也可以考慮等比例縮小體積，特殊情況如藥物量不足，且價格昂貴，或當用藥典緩衝液無法維持介質的pH值時除外。
儀器允許的情況下可採用小體積的溶解度介質( 比如50 mL) 。
平衡溶解度的測定方法有許多種［14-17］，如搖瓶法、酸鹼滴定法或其他方法。
應當證明所用方法的合理性，並且有方法學數據的支持。WHO 推薦的搖瓶法是基於40 年前開發的相溶解度技術，至今仍被大多數人認為是最可靠和最廣泛使用的溶解度測定方法［18-20］。
搖瓶法是使用定軌搖床等機械振蕩裝置，應能控制保持在( 37 ± 1) ℃，並設置適當的振蕩速率，採用適當的方法驗證。
振蕩速率應根據燒瓶或試管的形狀以及溶液的體積進行優化，保證藥物顆粒充分接觸稀釋劑，防止顆粒聚集，並避免形成渦流。
在優化好振蕩速率的情況下，一般樣品24 h 內即達到平衡［21］，也有的品種需要72 h 甚至更長時間，應在幾個不同時間點驗證樣品是否達到平衡。
如果藥物的潤溼性較差，浮在溶解度介質表面的話，可以藉助玻璃微珠等工具通過攪拌或超聲使顆粒分散。
一旦成功達到潤溼性，平衡溶解度實驗會繼續走向平衡。
3.2 用於平衡溶解度測定的緩衝液
pH-溶解度曲線應在pH 1. 2 ～ 6. 8 內測定，藥物的溶解度分類是根據上述pH 值範圍內的最低溶解度。
根據研究的可變性，至少在pH 1. 2，4. 5，6. 8 條件下平行測定3 份以上，例如，0. 1 mol·L－1鹽酸溶液或pH 1. 2 模擬無酶胃液，pH 4. 5 乙酸緩衝液以及pH 6. 8 磷酸緩衝液。
以藥物的離子化特性為依據來決定pH 值的個數，如果已經知道藥物在上述pH 範圍內水介質中的最低溶解度( 如pKa) ，也需要測定在那個pH 時的溶解度數值。
在相同溫度下［如( 37 ± 1) ℃］調節緩衝液的pH 值。當藥物加入到作為溶劑的緩衝液中，此時溶劑的pH 值需要用校準過的pH 計進行驗證，實驗結束後需要再次驗證pH 值。
如果緩衝液與溶質結合後pH 發生了改變，可用適當的酸或鹼溶液調節pH 值，或者使用更強緩衝能力的緩衝液。
調節pH 值後，緩衝液需要至少平衡1 h 後再加入樣品。WHO 推薦的緩衝液配製方法如下，相關試劑的配製可查閱《國際藥典》:pH 1. 2 緩衝液: 稱取2. 52 g 氯化鈉，加入900mL 水使溶解，用鹽酸溶液( 約70 g·L－1) 調節pH值為1. 2，再用水稀釋至1 000 mL。
pH 4. 5 緩衝液: 稱取2. 99 g 乙酸鈉，加入900mL 水使溶解，用醋酸溶液( 約120 g·L－1) 約14 mL調節pH 值為4. 5，再用水稀釋至1 000 mL。
pH 6. 8 緩衝液: 稱取6. 9 g 磷酸二氫鈉和0. 9 g氫氧化鈉，加入800 mL 水，用氫氧化鈉試液( 約80g·L－1) 調節pH 值為6. 8，再用水稀釋至1 000 mL。
3.3 預實驗
建議根據藥物特性進行預實驗，初步評估達到平衡的時間、預期溶解度以及關鍵實驗需要的樣品量。
在 5 mL( 或選定的體積) pH 1. 2，4. 5 和6. 8 緩衝液中加入過量30% ～ 40% 的固體，測定溶液中固體的量。
如果使用5 mL 緩衝液的話，可將固體加入10 mL 試管中。緩衝液體積的確定對應於預期的最小溶解度，如果溶解度大於預期值，則將體積減小至3 mL; 如果預期溶解度低且樣品量足夠，則使用更高的體積。
或者體積保持在5 mL，通過增加或減少樣品量調整。
檢查是否有未溶解的固體; 如果固體完全溶解至緩衝液中，應向試管中添加額外的固體直至有固體保持不溶解的狀態為止。
解決與固體潤溼性或聚集有關的任何潛在問題，可在試管中加入玻璃微珠後機械振搖或磁力攪拌。
製成飽和溶液後，每個pH 至少製備3 份樣品，在不同時間點取樣測定溶質的溶解量。
建議在約6個時間點( 比如2，4，8，24，48，72 h) 測定溶液的濃度直至每次測定之間不再有顯著差異，以確定藥物達到平衡所需要的時間。
取出溶液後須立即過濾樣品( 如使用0. 45μm 濾膜) 或離心分離未溶解的樣品，當介質體積小時建議採用過濾的分離方式，離心也是一種有效的替代方法。
溶解度實驗是在( 37 ± 1 ) ℃ 條件下操作，如果分析測定之前需要將樣品在室溫下放置，則樣品離心或過濾後應立即稀釋，以避免溶質析出。
到達藥物濃度隨時間變化的平臺期所需的最短時間可認為是合適的平衡時間。確定達到平衡的時間後，應再次測定緩衝液的pH 值。
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3.4 穩定性
應監測藥物在pH 範圍內的穩定性，以測定真實的溶解度［22-23］。
如有收載的話，採用國內外藥典確認過的分析方法分析藥物及其降解產物，比如高效液相色譜法( HPLC) 、分光光度法或其他確認過的分析方法。
因HPLC 可用於雜質和不穩定性的檢測，故與分光光度法相比，建議優先選擇HPLC。應當關注緩衝液組成或pH 是否會導致藥物的降解。
如果沒有適合的穩定性分析方法，則需要進行單獨的穩定性實驗以證明樣品在緩衝液介質中是穩定的。
3.5 分析方法
建立標準曲線，最好使用5 ～ 6 個濃度水平作線性回歸，估算截距、斜率和相關係數，使用另外3 個控制濃度點獨立評估精密度和準確度。
如有必要，稀釋後的樣品應在標準曲線的範圍內，記錄稀釋因子進行反算。
每份樣品進2 針並建立標準曲線。
預計至少運行3 ～ 4 次分析( 例如，首先是2，4，8h 的樣品，然後可能還需要另外3 次24，48 和72 h 的樣品) ，這取決於樣品的穩定性。最後對數據進行日內、日間精密度和準確度的評估。
一般情況下，控制濃度點和樣品是穿插進樣的。為了考察過濾的影響，控制濃度點可以在過濾前後分別進樣。
回收率應在98%～ 102%之間( 如果小於這個值表明發生了濾膜吸附; 如果大於這個值表明濾膜的成分在影響分析) 。
有必要的話可以更換過濾方式。評估專屬性，線性，範圍，準確度，重複性和中間精密度，應符合最低接受限度。
3.6 關鍵實驗
根據預實驗的結果設計關鍵實驗。
下列步驟是進行關鍵溶解度實驗的一般例子:
每個pH 條件需平行3 份進行評估，稱取約過量10%的樣品( 通過預實驗確定) 置燒瓶中，加入適當體積的緩衝液( 至少pH 1. 2，4. 5，6. 8 緩衝液3種) ;
混勻後測定pH 值;
設置搖床的溫度和振蕩速率，把燒瓶放入搖床中固定;
根據預實驗評估的平衡時間，取出一部分懸浮溶液;
立即過濾或離心分離未溶解的樣品;
記錄實驗結束時溶液的pH值;
定量分析前儘快稀釋樣品，避免析出;
測定藥物的濃度。
3.7 結果報告
溶解度以mg·mL－1表示。
每個實驗條件重複溶解度結果的相對標準偏差( ＲSD) 應不大於10%。
劑量-溶解度體積( DSV) 表示在觀察到溶解度最低的pH 條件下，完全溶解藥物的最高單次治療劑量所需的溶液體積。
DSV 可以通過將藥物最高單次治療劑量( mg) 除以研究中測得的溶解度( mg·mL－1) 計算得到。
當DSV 在整個pH 1. 2 ～6. 8 內小於250 mL 時，藥物被認為是高溶。
4
影響溶解度的因素
藥物的溶解度不僅受藥物的比表面積、粒度、晶型等物理化學性質的影響，還受介質的性質影響，如pH、極性、表面張力、添加表面活性劑、助溶劑、鹽等，而且受溫度和振蕩時間等溶解度實驗參數的影響。
表1［9］是一些已發表的水溶解度數值變異範圍大的例子。
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4.1 緩衝液的組成
選擇溶解度測定的介質與其應用有關，當結果旨在預測吸收或生物利用度時，建議使用一種生物相關的介質溶液; 當結果旨在支持溶出方法開發時，建議使用溶出介質。
當評估化合物的pH 依賴性時，建議緩衝液在一個寬的pH 範圍內控制離子強度和反離子類型。
弱酸和弱鹼在介質中的離子化程度取決於化合物的pKa 值和介質的pH。
4.2 過量固體的量
藥物在溶液中達到平衡需要加入過量的固體，過量固體的量是否會影響平衡溶解度數值目前還沒有確定的結論。
Kohsaku 等［24］考察了過量固體對吲哚美辛平衡溶解度的影響，pH 5 和6 時平衡溶解度隨過量固體的量增加而減少，pH 6. 5 和7 時則相反，平衡溶解度隨過量固體的量增加而增加。
Edit等［9］測定了每5 mL 介質中分別過量4、8、12、16、20mg 時氫氯噻嗪的平衡溶解度( 圖1) ，結果則沒有顯著差異。
建議為了避免取樣困難，過量固體的量在保證足夠的基礎上不宜太多，例如每5 mL 介質過量5 ～ 10 mg 即可。
4.3 溫度
眾所周知，溶解度與溫度有關，因此平衡溶解度實驗必須在恆定溫度下進行。由於藥物有吸熱溶解的過程，溶解度會隨溫度的升高而增加，故大多數藥物在體溫37 ℃ 時的溶解度會高於室溫25℃的溶解度。
這在藥物設計中是一個優勢，可以預期體內有更好的生物利用度。
因此體溫和室溫條件下測定得到的平衡溶解度數值是非常有用的數據支持。
4.4 振蕩時間
振蕩是搖瓶法達到平衡的重要步驟，振蕩時間越長，藥物的溶解度越大，因此嚴格應用搖瓶法的話，應首先確定藥物達到平衡所需要的振蕩時間再測定溶解度。
4.5 沉降時間
振蕩溶解後，需將多餘的固體完全沉降後取上清液。
研究表明，沉降時間對平衡溶解度的測定結果亦有影響。
Edit 等［9］考察了分別沉降1 ～ 24 h 後取樣測定，結果有些出人意料。
沉降1 ～ 8 h 測定的氫氯噻嗪溶解度數值較大，以沉降6 h 最大。
而12h 以後的溶解度卻顯著減小，有待考察是否由於測定誤差導致，見圖2。
4.6 相分離技術
相分離技術是搖瓶法測定的關鍵部分。
振蕩溶解後，溶液和固體兩相需要分離後取上清液進行HPLC 或UV 等分析測定。
取出的上清液必須完全澄清，不含任何固體粉末。
自然沉降被認為是最安全的相分離技術，但其耗時長，且當化合物形成膠束或聚合物產生乳白色溶液時，溶液則難以澄清，對於這種樣品，只有通過離心的方法來解決，因此離心或過濾的相分離技術也是一種很好的選擇。
然而選擇離心或過濾時有時可能會造成測定的平衡溶解度數值比真實值高，分析原因有: 振蕩過程中有可能形成過飽和溶液，停止振蕩後立即過濾或離心導致結果偏高; 溶液中懸浮的粒子可能小於濾膜的孔徑，導致濾液的濃度偏高; 固體粉末較為鬆散的話，離心後取上清液時可能會混入粉末，造成溶解度測定結果偏高。
5
小結
目前測定平衡溶解度沒有公認的標準方法，由於實驗方法不同，導致了同一藥物不同來源的BCS分類存在差異。
本研究詳細闡述了平衡溶解度實驗的基本程序和技術要求，分析研究了影響溶解度測定的多方面因素，以規範平衡溶解度實驗在BCS 分類和生物等效性豁免中的應用，希望對我國仿製藥質量與療效一致性評價工作的順利開展起到積極的作用。
參考文獻
詳見 中國藥學雜誌2019 年8 月第54 卷第16 期