使所需要的報導基因載體具備Gateway兼容性，包括利用傳統的限制性內切核酸酶和連接方式將att位點包圍的Gateway盒克隆到載體骨架上的合適位置，以及在大腸桿菌DB3.1菌株中轉化和繁殖環化的產物。
由於這種新質粒可以像目的載體-樣接受來自於入門克隆的插入片段，因此使用兼容性的att 位點至關重要(如果預期的載體需要接受來自於pDONR221克隆的可讀框，那麼就需要有attRl-attR2位點)。
根據載體的不同，將att位點以專門的可讀框方式進行克隆可能也很重要(這樣每一一個重組的可讀框均可以按正確的閱讀框與氨基或羧基端融合表達)。
目前市售有包含attR1和attR2包圍的Gateway盒的平末端DNA片段，含三種不同的可讀框，可以用來連接目的載體。如果需要不同的att位點，可以用PCR方法從現有的載體中擴增相似的片段。
如果沒有含有所需要的att位點，那麼可以採用PCR介導的點突變方法對已有att位點進行修飾(參見第14章)。
在現代分子遺傳學研究中，最重要的是基因靶向特定的細胞型。表達特定的基因是不同細胞類型的特徵，為了促進表達的研究，人們開發了兩種方法用於協助遺傳信息轉移到外源宿主細胞中。
第一種方法，通過在胚胎幹細胞中同源重組將新的遺傳信息整合到內源的基因座，用於產生「基因靶向」的小鼠品系( Capecchi 1989; Thompson et al.1989;Joyner and Sedivy 2000; Turksen 2006; Nortarianni and Evans 2006)。