基因編輯遭遇重大危機,Cas9蛋白有潛在致癌性,促進p53突變富集

導讀：5月18日，Broad研究所 Uri Ben-David 團隊在 Nature Genetics 雜誌發表論文，證實Cas9本身能夠激活多種細胞系中的p53通路，並促進p53失活型突變的選擇性富集。進一步表明了Cas9蛋白本身具有潛在致癌性，給基於CRISPR/Cas9基因編輯的臨床治療帶來新的疑問。

1953年，沃森、克裡克等發現了DNA雙螺旋結構，人類自此開啟了分子生物學時代，在此後短短的幾十年裡，美麗而又複雜的生命之迷被人類快速破解。

2013年，CRISPR/Cas9基因編輯技術誕生，人類開始進入一個新的時代，在這個時代裡，人類得以快速精準地操縱基因、改變生命，攻克癌症、擺脫遺傳病...曾經那些遙不可及的夢想從此變得觸手可及。

CRISPR/Cas9是一個優美的工具，然而，這個工具絕非完美，自誕生時起，CRISPR/Cas9就伴隨著脫靶性的擔憂。實際上，隨著基因編輯技術的優化，脫靶性已不是Cas9面臨的最大問題，而更多的風險因素逐漸開始暴露。

Cas9基因編輯的潛在致癌性

2018年6月12號，Nature Medicine雜誌背靠背發表了兩篇來自瑞典卡羅琳斯卡學院和諾華生物醫學研究所的研究論文。

這兩篇論文均表明，CRISPR/Cas9系統能夠激活p53引起的DNA損傷，p53是最著名的抑癌基因，p53會判斷DNA變異程度，如果變異較小，就促使細胞自我修復，若DNA變異較大，就誘導細胞凋亡。

正常的p53基因會抑制CRISPR/Cas9基因編輯，也就是篩選到的成功被編輯的細胞，p53基因很可能有缺陷，細胞癌變風險提高，如果將通過CRISPR/Cas9基因編輯的細胞用於治療，將會有潛在致癌性風險。

CRISPR/Cas9破環染色體穩定性

2018年8月8日，澳大利亞阿德萊德大學 Paul Q. Thomas等人在 Nature 發表了題為：Large deletions induced by Cas9 cleavage 的研究論文，發現CRISPR/Cas9基因編輯後的小鼠受精卵中出現頻繁的大量鹼基缺失（千鹼基量級）。

2019年3月8日，法國波爾多大學的研究人員在 Nature Communications 雜誌發表題為：CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations 的研究論文。

該研究發現CRISPR/Cas9基因組編輯會誘導出現百萬鹼基規模的染色體大片段缺失。這麼大長度的片段缺失，比脫靶效應更為嚴重，該研究中雙鏈斷裂造成的染色體截短，直接造成了43個基因的丟失，這43個基因中，5個是原癌基因，7個是抑癌基因，令人震驚的是，這7個抑癌基因中有5個是抑制白血病的抑癌基因。這些抑癌基因的丟失，很可能會導致細胞癌變。

這項研究也揭示了CRISPR/Cas9誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）對人類細胞基因組的全局性破壞作用。

人體對Cas9蛋白存在免疫反應

2019年1月28日，史丹福大學的研究人員在 Nature Medicine 雜誌發表題為：Identification of Pre-Existing Adaptive Immunity to Cas9 Proteins in Humans 的論文。該論文證實人體預先存在針對Cas9蛋白的免疫應答。

雖然多種Cas9同源物已經被鑑定，但是最完善的系統來源於金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌。金黃色葡萄球菌Cas9（SaCas9）主要用於體內編輯，因為它可以更容易地包裝到AAV載體中。臨床前研究顯示釀膿鏈球菌Cas9（SpCas9）在體外和體內具有巨大的治療潛力。

而金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌是常見的人類共生體，也是致病性病原體，許多人曾感染過這兩種病菌，研究人員發現，在人血清中可以檢測到SaCas9和SpCas9的IgG抗體，而許多健康人類具有針對SaCas9的預先存在的抗原特異性T細胞。

這項研究表明，人類對Cas9蛋白預先存在的適應性免疫應答很可能會妨礙CRISPR/Cas9系統安全有效地用於治療疾病，甚至可能對患者產生顯著的毒性。

Cas9蛋白促進p53突變富集

2020年5月18日，Broad研究所 Uri Ben-David 團隊在 Nature Genetics雜誌發表了題為：Cas9 activates the p53 pathway and selects for p53-inactivating mutations 的研究論文。

該研究發現，在沒有外源sgRNA的情況下，Cas9蛋白的過表達能夠激活多種細胞系中的p53通路，並促進p53失活型突變的選擇性富集。

Cas9過表達對細胞的影響

研究還發現，Cas9在p53正常的細胞系中的活性遠低於p53突變細胞系，並且Cas9誘導的p53途徑激活影響細胞對遺傳和化學篩選的敏感性，進而影響篩選結果。

結語

基因編輯在臨床應用最基礎的要求就是準確性與安全性。作為涉及DNA層面的遺傳操作，基因編輯的副作用對病人造成的傷害無疑是可怕的，因此基因編輯技術進入臨床使用需要慎之又慎。

對於準確性來說，CRISPR/Cas9基因編輯技術自誕生以來，脫靶效應始終令人擔憂，脫靶性通常是由於對DNA的錯誤切割造成的，除了提高CRISPR系統靶向的精準性以外，開發DNA切割活性喪失的dCas9，以及不依賴DNA雙鏈斷裂的單鹼基編輯器也重要的方向。

對於安全性來說，人體對細菌來源的Cas9蛋白的免疫原性反反應，CRISPR/Cas9激活p53引起的DNA損傷，引起染色體大片段缺失，以及引起p53失活突變的富集等等，都是CRISPR/Cas9在人體上應用的巨大障礙。

近幾年，CRISPR/Cas9基因編輯臨床試驗陸續開展，一些臨床試驗也展現了良好的效果，且短時間內未觀察到明顯的安全風險。這表明，CRISPR/Cas9基因編輯在人體上的應用已沒有不可逾越的障礙，我們需要做的就是解決這些已發現的問題，為發展出安全和有效的人類基因編輯臨床應用方案而努力。