基因編輯有風險! 《自然》:Cas9特異激活p53途徑,增加p53突變

常言道，技術是把雙刃劍。

身為科研利器的CRISPR-Cas9技術，暴露了它朝向執劍人的鋒利一面。

近期，《自然·遺傳學》雜誌報導了一項最近研究成果，來自哈佛醫學院的科研團隊證實，Cas9蛋白表達本身就會特異性激活細胞中的p53通路，並誘導p53失活突變的出現和擴增[1]。

這意味著利用CRISPR-Cas9技術編輯基因，會促進p53突變細胞的出現，影響細胞對遺傳變異和藥物的敏感性，甚至導致癌症的發生。

圖源 | pixabay

在2018年年中，《自然醫學》雜誌曾同期刊登了兩篇背靠背論文，兩個科研團隊獨立發現了CRISPR-Cas9基因編輯過程中由DNA雙鏈斷裂引起的p53通路激活，提示基因編輯成功的細胞很可能具有p53缺陷，也就是潛在的癌細胞。

不過細想這事兒也算不得稀奇，畢竟p53本身的職責範圍就包括對DNA損傷的修復，「幹擾」CRISPR-Cas9起效，又或者是讓損傷細胞自殺，這都是本職工作。當時研究者們認為，不涉及切斷DNA雙鏈，那麼這種風險還是可以規避的。

不過，Cas9蛋白本身的表達，是否就毫無擔心之處呢？

真相顯然並不讓人放心。

為了搞清楚這個問題，研究者們對165個表達Cas9的細胞系和它們對應的野生型細胞進行 L1000分析[2]，結果在二者之間觀察到了巨大的轉錄差異，87個（中位數）基因的表達差在兩倍以上。基因集富集分析（GSEA）[3]顯示差異表達的基因普遍位於MSigDB標誌基因集中[4]。

大量基因表達出現了差異

那麼，與野生型細胞對比在表達Cas9的細胞中是否有一些特定的被激活的基因呢？

有的，那就是p53。

在GSEA分析結果中，15.2%的細胞系都表現出p53通路的顯著激活，而且值得注意的是這個比例在p53正常的細胞系中是33%，在p53突變的細胞系中則只有9%。免疫印跡法也證實，Cas9表達會引發正常p53細胞相關通路的激活。RT-qPCR則顯示，多個p53轉錄靶點mRNA水平升高了。

為了排除其他幹擾因素，研究者還做了進一步的對比實驗，確定對p53的激活確實是由Cas9表達引起的，而不是病毒轉導、其他基因過表達的影響或者是技術問題導致的。

除了p53之外，NF-κB信號也表現出了高度激活。這二者都是DNA損傷的監視者，很明顯，Cas9表達後存在DNA損傷。

這一點也在接下來的實驗裡得到了證實。一方面，研究者觀察到了19.4%對細胞系中出現了DNA修覆信號的富集；另一方面，免疫螢光檢測也證實Cas9表達增加了DNA雙鏈斷裂的數量。

免疫螢光顯示Cas9表達增加了DNA雙鏈斷裂

P53是基因編輯的一道屏障，反過來想，Cas9的引入也會使得p53失活的細胞更容易存活。為了驗證這個猜想，研究者對42對細胞系中447個癌基因進行了外顯子組測序，測序深度達到283x。

如果只考慮編碼序列的非同義單核苷酸突變（SNVs）和插入缺失（indel），與野生型細胞對比，平均每個表達Cas9的細胞系新增了2.6個突變，丟失了1.3個突變。總的來說，Cas9的引入帶來了4.5個非沉默癌基因突變。

在最容易獲得新突變的基因中，p53正排在前4%。

Cas9引入易導致突變的基因（局部）

研究者還分析了所有447個癌基因的擴增趨勢，對比了p53和其他所有基因出現沉默突變和非沉默突變的比例，p53同樣名列前茅。與其他對照實驗的結果相比，可以認為，Cas9表達對p53失活突變有獨特的選擇性，明顯區別於其他的腫瘤抑制基因突變。

研究者進一步測試了Cas9誘導p53激活的影響，發現表達Cas9的細胞對MDM2抑制劑nutlin-3的藥物敏感性顯著上升了。

簡單總結一下，在人類細胞系中引入Cas9表達會激活p53通路，誘導p53突變的出現和擴增。Cas9誘導的DNA損傷可能是p53活化的基礎，但是其間具體的分子機制還有待進一步闡明。

雖然既往研究認為，病毒轉導以及sgRNA的存在會導致p53激活，不過本研究證實，僅僅Cas9表達本身就會誘導特異性p53激活，這將對細胞的功能產生不可知的影響，成為CRISPR技術應用中的未知數。

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參考資料：

[1]Enache O M, Rendo V, Abdusamad M, et al. Cas9 activates the p53 pathway and selects for p53-inactivating mutations[J]. Nature Genetics, 2020: 1-7.

[2] Subramanian, A. et al. A next generation connectivity map: L1000 platform and the frst 1,000,000 profles. Cell 171, 1437–1452 e17 (2017).

[3] Liberzon, A. et al. Te Molecular Signatures Database (MSigDB) hallmark gene set collection. Cell Syst. 1, 417–425 (2015).

本文作者 | 代絲雨