CRISPR-Cas9系統在基因編輯領域具有劃時代的意義，並被廣泛用於基礎研究和臨床應用研究。其發揮基因編輯的基本原理是，Cas9蛋白與sgRNA形成複合物切割靶位點引入DNA雙鏈斷裂（DSBs），之後由非同源重組修復（NHEJ）途徑誘導插入缺失突變，或在DNA修復模板的存在下通過同源重組修復（HDR）途徑實現精準基因編輯。然而，作為外源性過表達的核酸酶，Cas9很可能有潛在的安全風險。2018年，有研究者指出，CRISPR系統能激活p53而引發DNA損傷（詳見BioArt報導：）【1,2】，之後研究者還發現，CRISPR-Cas9還會在DSBs位點停留而導致大片段缺失乃至各種複雜的染色體結構異常（詳見BioArt報導：）【3】。由此可見，CRISPR-Cas9系統的安全性仍需進一步評估。
2020年3月14日，來自中山大學第八附屬醫院、深圳市兒童醫院的付雪梅實驗室與南方醫科大學腫瘤研究所徐洋實驗室合作在Protein&Cell雜誌上發表了題為CAS9 is a genome mutator by directly disrupting DNA-PK-dependent DNA repair pathway的論文。文章發現了Cas9引發DNA損傷的新機制。研究指出，在沒有外源sgRNAs的條件下，Cas9蛋白依然可直接結合DNA-PK複合物中的KU86亞基，進而抑制DNA-PK複合物依賴的NHEJ修復通路引發DNA損傷。研究還發現，Cas9突變體xCas9和dCas9能通過相同的機制引發DNA損傷。這提示我們，CRISPR-Cas9系統的安全性仍有待進一步提高。
之前研究者多關注sgRNA存在的條件下，CRISPR-Cas9系統存在的安全隱患，Cas9蛋白本身對基因組穩定性的影響依然缺少研究。本文中研究者首先構建出Dox誘導的條件性表達Cas9的人胚胎幹細胞系（hESCs）模型，並在此基礎上分析Cas9蛋白對基因組穩定性的影響。結果發現，Cas9過表達能激活DNA損傷應答通路，誘導DSBs標誌物——γH2AX焦點的形成（圖1）；彗星實驗也證實，Cas9本身便可誘導DSBs損傷，進而激活p53下遊靶基因的表達而導致hESCs的死亡和分化。研究者還在人誘導多能幹細胞（hiPSCs）和人成纖維細胞中證實了Cas9誘導DSBs損傷激活DNA損傷應答通路的能力。研究還發現， Cas9誘導DSBs損傷的能力與劑量無關，低劑量的Cas9蛋白便足以引發DNA損傷。
圖1 Cas9過表達誘導γH2AX焦點形成
為探究Cas9誘導DSBs損傷的機制，研究者通過蛋白免疫共沉澱對其相互作用因子進行了分析，結果顯示，Cas9蛋白能通過C末端結構域直接結合KU86 而破壞DNA-PK複合物的形成。考慮到DNA-PK複合物是NHEJ修復通路的關鍵因子，研究者進一步分析了Cas9過表達對DSBs損傷後修復通路的影響，結果顯示，Cas9過表達能明顯抑制NHEJ修復通路的進行，而對HDR修復通路影響甚微。
最後研究者還發現，Cas9的高保真突變體xCas9及失活體dCas9同樣能結合KU86破壞DNA-PK複合物的形成，幹擾NHEJ修復通路的進行，最終導致DNA損傷和基因組不穩定性。
總體而言，本研究通過一系列實驗證實，Cas9及其各種突變體能直接結合DNA修復通路的關鍵因子KU86，幹擾DNA-PK複合物的形成，抑制NHEJ修復通路介導的DNA損傷修復，導致DNA損傷和基因組不穩定性。本研究提醒我們，研究者對CRISPR-Cas9系統安全風險的認識仍有不足之處，在開展相關的臨床研究時還須保持謹慎態度。
原文連結：
https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-020-00699-6
參考文獻
1. E. Haapaniemi et al., CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med, (2018).
2. R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med, (2018).
3. Michael Kosicki et al., Repair of CRISPR–Cas9-induced double-stranded breaks leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol, (2018).
本文轉載自公眾號「BioArt」（BioGossip）
中國生物物理學會官方訂閱號，為BSC會員及生物物理領域專業人士服務。
投稿及授權請聯繫：bscoffice@bsc.org.cn。
微信號：BSC-1979
原標題：《【科技前沿】CRISPR-Cas9系統的新風險——破壞DNA-PK依賴的修復通路引發DNA損傷》