撰文 | 木蘭之枻
責編 | 兮
目前已知的人類致病遺傳變異中，約58%都屬於點突變，而約15%的致病點突變都屬於T·A--C·G變異【1】。2016年哈佛大學David Liu實驗室開發出新型單鹼基編輯器CBE（Cytosine Base Editor），可實現C·G--T·A鹼基對的轉換，這對上述的點突變遺傳病的治療有重要意義，因而在基因治療領域的應用前景相當廣闊【2】。
不過，2019年有研究通過全基因組測序分析指出，除了傳統的Cas9非特異性結合導致的DNA脫靶風險之外，CBE系統還存在Cas9非依賴型的DNA脫靶風險【3-4】，這極大地限制了CBE系統的應用。
目前，CBE系統的Cas9非依賴型脫靶風險評估主要依賴於全基因組測序分析，該方法雖然全面，但耗時費力，花費不菲，難以用於規模化的評估和篩選，因而極大的限制了相關研究的開展，對CBE系統的優化和未來應用極為不利。
2020年2月10日，來自Broad研究所、哈佛大學化學系和化學生物系的David Liu實驗室在Nature Biotechnology雜誌上發表了題為Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors的論文。文章對多種CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶風險進行了評估並加以優化。文章開發出較全基因組測序更為快速、便捷且經濟的實驗策略，並以此為基礎對CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶風險進行了有效評估；之後研究者還通過蛋白質工程等策略對CBE系統進行優化，有效地減少了Cas9非依賴型DNA脫靶風險的發生。
首先，研究者嘗試通過細菌水平的利福平耐藥實驗來檢測CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶風險。其基本原理是，如若CBE系統中的胞苷脫氨基酶可誘發大腸桿菌中rpoB基因上的C-T突變，會導致大腸桿菌耐受利福平，之後根據耐藥克隆的比例便可評估其Cas9非依賴型DNA脫靶風險。
此外，研究者會同時在大腸桿菌中轉入靶位點上攜有T-C失活突變的氯黴素抗性基因表達載體，根據氯黴素抗性克隆的比例，便可同時評估CBE系統的鹼基編輯活性。在證實了系統的有效性之後，研究者首先對CBE系統的三種組分胞苷脫氨基酶、dCas9及UGI與Cas9非依賴型DNA脫靶風險的關係進行分析，發現胞苷脫氨基酶和UGI是關鍵。這兩者之中，胞苷脫氨基酶誘導利福平耐藥的能力是UGI的上百倍，因而成為後續研究的重點所在。
之後研究者發現APOBEC3G，AID，eA3A和APOBEC1的多種突變體如YE1等為基礎的CBE系統能降低Cas9非依賴型DNA脫靶風險。此外，考慮到胞苷脫氨基酶的活性多存在序列偏好性，研究者還嘗試用細菌胸苷激酶基因突變實驗進行評估以保證結果的準確性並獲得相似的結果。
先前的研究和上述的細菌實驗均證實，CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶頻率低於~0.1%，傳統的定點擴增難以有效檢測。為替代全基因組測序，研究者設計出可在人源細胞系中開展的R-loop實驗方案，此方案可放大CBE系統在特定位點的Cas9非依賴型脫靶頻率，之後便可通過定點擴增加以檢測和評估。
其基本原理是，通過不同類型的CRISPR系統在基因組特定位點誘導出單鏈DNA區域（ssDNA域），以「放大」該區域CBE系統的Cas9非依賴型胞嘧啶脫氨基頻率，之後便可通過定向擴增和高通量測序加以檢測。
實際操作中，研究者在293T細胞中共轉染SpCas9為基礎的CBE系統及spsgRNA，失活型SaCas9（dSaCas9）及sasgRNA，之後檢測sasgRNA靶位點的胞嘧啶脫氨基頻率。通過該實驗，研究者發現，APOBEC1的多種突變體如YE1、YE2、EE、YEE、R33A和R33A/R34A為基礎的CBE系統有著最低的Cas9非依賴型DNA脫靶風險（圖1a-b）。
根據以上結果，研究者推測，Cas9非依賴型DNA脫靶風險主要取決於胞苷脫氨基酶的催化效率，理想的CBE系統應當有著較低的催化效率，以保證在底物低濃度時處於失活狀態（脫靶風險低）而在底物高濃度時方發揮催化功能（保證靶位點的編輯效率）。體外動力學研究證實，與野生型rAPOBEC1相比，YE1為基礎的CBE系統（YE1-BE4）對ssDNA的催化效率降低了69倍之多。隨後293T細胞中的ssDNA脫氨基實驗也證實了以上結論。而全基因組測序分析也證實，YE1為基礎的CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶風險有明顯降低，與單純的nCas9風險相似（圖1c-d）。
總體而言，研究者通過細菌中的利福平耐藥和胸苷激酶基因突變實驗以及人源細胞系中的R-loop實驗、體外動力學實驗和細胞內ssDNA脫氨基實驗證實，較低的催化效率是CBE系統Cas9非依賴型DNA脫靶風險降低的基礎。
圖1（a-b）R-loop實驗分析不同CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶風險；（c-d）全基因組測序分析YE1-BE4的DNA脫靶風險。
雖然YE1-BE4幾無明顯的Cas9非依賴型DNA脫靶風險，其活性窗口明顯小於傳統的CBE系統BE4，這限制了其應用。為此研究者嘗試通過蛋白質工程拓展YE1為基礎的CBE系統的活性窗口。首先，通過替換nCas9為nCas9-NG突變體，YE1-NG可識別的PAM位點從NGG拓寬為NG。研究者還通過替換nCas9為環化排列的Cas9（CP-Cas）變體CP1028得到YE1-BE4-CP1028，其活性窗口與BE4相似。
隨後為證實優化過的CBE系統在其它方面的安全性，研究者對YE1等rAPOBEC1突變體為基礎的CBE系統的Cas9依賴型DNA脫靶風險進行檢測，證實其Cas9依賴型DNA脫靶風險也明顯降低。此外，YE1-BE3等多種CBE系統的RNA脫靶風險也明顯降低。除蛋白質工程外，研究者還指出，通過核糖核蛋白轉染等方式減少CBE系統在細胞內的存留時間也能有效降低Cas9非依賴型DNA脫靶風險。
總體而言，本研究通過一系列快速、便捷和經濟的實驗策略對多種CBE系統的Cas9非依賴型DNA脫靶風險進行了系統性的分析與比較，找到了降低Cas9非依賴型DNA脫靶風險的關鍵；並通過蛋白質工程等策略構建出一系列低脫靶風險的高活性CBE系統，為CBE系統的未來應用提供了助力。
值得一提的是，2月9日，中科院神經科學研究所楊輝團隊在預印版平臺bioRxiv發表文章High-fidelity base editor with no detectable genome-wide off-target effects。
David Liu文章先是在細菌（文章圖1）和HEK293（文章圖2）中建立了一套快速和成本更低的篩選Cas-independent脫靶的方法，發現YE1-BE4, YEE-BE4 and R33A + K34A-BE4等脫靶概率低。然後發現YE1-BE4的on-target效率更好（文章圖3a,3b），並用WGS驗證了YE1-BE4的脫靶效率確實是低。最後建立了YE1為基礎的不同版本的base editors，發現YE1-BE4和BE4編輯效率差不多，但是DNA和RNA脫靶都很少。
楊輝團隊的文章先是篩選了不同版本的base editors，挑選出on-target效率和WT base editor差不多的版本——YE1、FE1、R132E、R126E，然後用GOTI和RNA-seq分別檢測他們的DNA 和RNA脫靶，發現YE1、FE1、R132E都不脫靶。
相同點：發現YE1是最好的版本，on-target效率不變，DNA和RNA脫靶同時減少；on-target編輯窗口都變窄；
不同點：David Liu是用多位點粗篩多方法快速找到脫靶低的candidate，然後用WGS驗證。楊輝團隊用GOTI和RNA-seq同時驗證，發現了DNA脫靶和RNA脫靶並不完全一致，有些版本有DNA沒有RNA脫靶，有些有RNA沒有DNA脫靶，需要同時檢測。
總體來說，這兩篇文章用不同篩選策略，得到相似結果，很好的印證了彼此的發現。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0414-6
製版人：琪醬
參考文獻
1. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing:precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.Nat Rev Genet(2018).
2. A. C. Komor, Y. B. Kim, M. S. Packer, J. A.Zuris, D. R. Liu, Programmable editing of a target base in genomic DNA withoutdouble-stranded DNA cleavage.Nature533, 420-424 (2016).
3. Zuo E, Sun Y, Wei W, Yuan T, Ying W, Sun H,Yuan L, Steinmetz LM, Li Y, Yang H. Cytosine base editor generates substantialoff-target single-nucleotide variants in mouse embryos.Science. 2019 Apr19;364(6437):289-292.
4. Jin Shuai., Zong Yuan., Gao Qiang., ZhuZixu., Wang Yanpeng., Qin Peng., Liang Chengzhi., Wang Daowen., Qiu Jin-Long.,Zhang Feng., Gao Caixia., (2019). Cytosine, but not adenine, base editorsinduce genome-wide off-target mutations in rice.,Science, 364, 292-295.