第三代ALK抑制劑Lorlatinib(輝瑞)的發現

背景

間變性淋巴瘤激酶(ALK)是胰島素受體家族的一種受體酪氨酸激酶，主要在成人腦組織中表達，在神經系統的發育和功能中起重要作用。

 

ALK最初被確定為融合蛋白NPM-ALK的一部分，該融合蛋白是由間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)中染色體2和5之間的相互易位產生的。

 

隨後，在瀰漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、炎性肌纖維母細胞瘤（IMTs）、非小細胞肺癌（NSCLC）中也發現了其他的ALK融合蛋白。

 

過去20年，超過20種ALK融合蛋白在各種癌症中被發現。2007年，EML4-ALK融合蛋白在3-7%的NSCLC患者中被發現，至此，醫藥領域充分認識到ALK作為腫瘤治療靶點的潛在意義。

 

crizotinib是第一個被美國FDA批准的ALK陽性肺癌患者的一線治療藥物（2011）。crizotinib顯示了可觀的治療效果，然而病人最終出現耐藥性。患者腫瘤組織分析顯示耐藥性主要由於ALK基因發生了點突變，此外NSCLC患者可能發生腦轉移，現有的治療藥物血腦屏障滲透性較差，治療效果受到限制。

 

除crizotinib外，多種ALK抑制劑也已被用於復發性ALK陽性NSCLC患者的治療，例如AP26113、CH5424802、ASP3026、LDK378，然而，這些化合物對腦轉移的臨床影響以及與臨床前CNS暴露或腦腫瘤模型的關係尚不明確。

目標

基於背景分析，輝瑞的研究人員致力於發現具有CNS暴露及光譜抗癌活性的下一代的ALK抑制劑，用以克服耐藥性突變及腦轉移。此外，為了降低脫靶效應並提高治療指數，需要抑制劑具有較高的激酶選擇性。

 

達到目標的關鍵參數：親脂性效率（LE）和分子量MW

通過增加效價與親脂性的比率改善LE可以並行優化藥物ADME性質及安全性。此外，在該系列化合物中log D與氧化代謝具有一定相關性，可以通過改善LE來確保結構的改變不會進一步增加化合物代謝負擔。

 

由於分子量與細胞通透性反相關，因此降低分子量對於所需成藥性（包括CNS暴露）至關重要。

 

無大環的氨基吡啶/氨基吡嗪ALK抑制劑

化合物1對於臨床突變細胞系沒有顯示足夠的抑制活性並且顯示了較高的P-糖蛋白外排。優化的化合物6a雖然大大提高了野生型和L1196M突變抑制活性，但親脂性較高，需要引入極性基團來降低整個分子的親脂性，以獲得可接受的LipE和良好的代謝穩定性。這種極性和分子量的增加導致大鼠腦脊液藥物水平極低同時藥物外排較高。

這些無大環結構的化合物無法同時兼顧效價和合理的MDR BA/AB比率來達到有效的CNS暴露。

 

為了平衡各方面屬性，需要新的設計策略。

 

共晶

化合物6b與ALK共晶結構顯示，氨基吡啶核通過受體-供體基序與蛋白質的鉸鏈部分相互作用。苄基片段採用與甲氧基取代基共面的苄基氫構象，從而使A-1,3應變最小。苄基甲基和氟苯基都充滿了親脂性口袋。另外，芳基氟化物使鄰芳基CH基團極化，從而與Gly1269和Arg1253上的主鏈羰基分子緊密接觸並靜電互補。三唑環的取向在30°扭轉下與Gly1202殘基的CH緊密接觸，近似為CH供體-π相互作用。最終，配體下方的Leu1256殘基填充了抑制劑的U形結構所形成的疏水袋。

 

6h與ALK的共晶結構顯示，醯胺NH與水形成氫鍵，醯胺羰基通過水分子與His1124的羰基形成相互作用。6h與6i的交疊表明，醯胺的指向遠離三唑基團的表面（醯胺的二面角（CCCO）為45°，而三唑的角（CCNN）為64°，大約有20°的偏差）。因此，甲基未指向與G環中的Leu1122，Gly1123和Val1130進行更強疏水相互作用所需的方向。

總體而言，共晶結構表明這些U型抑制劑的結合構象顯示氟苯基「頭部」和芳雜環「尾部」較為接近，基於此分析，研究者將化合物「頭部」與「尾部」相連以鎖定化合物構象。這樣的結構修飾有望增強結合構象，減少可旋轉鍵數量，增加小分子緊湊程度，可能改善其滲透性，由LipE和MW優化驅動的基於大環的結構設計將可能在不犧牲效價的情況下提供獲得所需CNSADME性質的最高可能性。

 

大環ALK抑制劑

相對於無環化合物6b，大環類化合物均表現了改善的效價和LipE，然而大環醚通常過於親脂，LipE依然需要進一步改善以滿足效價、ADME、CNS暴露之間的平衡。

為進一步改善其LipE，研究者將醚鍵替換為內醯胺結構以降低親脂性。將相應的無環化合物環化為內醯胺大環化合物後，細胞效價提高將近10倍，親脂性降低了1個單位，且分子量沒有提高。此外大環化合物還證明了優良的代謝穩定性及滲透性。總而言之，大環化合物較高的LipE和較低的MW可以滿足CNS暴露需求而不犧牲效價和安全性。

選擇性的實現

在ALK的ATP結合口袋有27個殘基，ALKLeu1198殘基在26%的蛋白激酶中是保守的（其他激酶該位置最常見的為Phe或Tyr），這個較小的Leu殘基可能是獲得針對大多數激酶（60%）的選擇性的途徑。

 

對應替代包含Phe/Tyr殘基的激酶到ALK leu1198和TrkB。並且分析了幾個大環衍生物與ALK的共晶結構，測量化合物與TrkB的Tyr635之間的距離。結果表明，AL結構中吡唑鄰位的取代基可以接近TrkB Tyr635殘基中的原子，其距離小於該對原子的範德華半徑之和。其中8m與Tyr635距離最近，發生碰撞的可能性最大，此外，由於大環限制了化合物旋轉導致取代基無法朝向遠離Tyr/Phe殘基的方向旋轉。

CNS滲透

為了闡明提供低MDR外排量的理化特性，研究者對輝瑞MDR數據集進行了分析，該數據集在同一MDR滲透性模型中評估超過11.5萬種化合物。結果表明，隨著分子量或氫鍵供體數量（HBD）的增加，化合物流出機會增加。圖6的餅圖說明，與分子量，測得的log D和HBD計數相似的無環分子相比，大環抑制劑的MDR外排水平更低。值得注意的是，化合物8a、8l、8m顯示出MDR BA/AB明顯高於2.5，無法充分穿過BBB，而8j和8k均小於2.5，預計會進入CNS。

親脂性效率比較

為評估大環及無環化合物的親脂性效率指數差異，構建log D/重原子數與效價對應的散點圖。結果表明，大環化合物相對無環化合物普遍具有較高的親脂性效率（彩色方塊）。

優選化合物8k體內外參數

基於優異的效價、選擇性及平衡的ADME性質，化合物8k被優選出來進一步評價。相對化合物1，化合物8k顯著提高了對ALK的細胞抑制活性，此外對大量的ALK臨床突變細胞，8k的效價提高40-825倍。

對206個重組激酶進行篩選確認化合物8k有10個脫靶激酶，這些激酶相對於ALK-L1196M選擇性小於100倍。

 

藥代動力學結果顯示，優選化合物具有較低的血漿清除率，適中的的分布體積、半衰期及優異的生物利用度。

 

大鼠中10mg/kg口服化合物8k證明了其能成功實現CNS暴露。

總結

大環化合物相對於無環化合物具有顯著提高的效價及ADME性質（包括CNS暴露）。諸如TYK、MCl-1在內的眾多靶點也顯示了大環修飾策略的成功，是一種非常值得借鑑的修飾思路，但值得注意的是也應該考慮蛋白結合口袋的結構特點，不能一概而論，此外，成大環依然面臨化學合成的諸多挑戰。

 

參考文獻

Ted W. Johnson, etal. Discovery of(10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16-trimethyl-15-oxo-10,15,16,17-tetrahydro-2H-8,4-(metheno)pyrazolo[4,3-h][2,5,11]-benzoxadiazacyclotetradecine-3-carbonitrile(PF-06463922), a Macrocyclic Inhibitor of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) andc-ros Oncogene 1 (ROS1) with Preclinical Brain Exposure and Broad-SpectrumPotency against ALK-Resistant Mutations. J. Med. Chem. 2014, 57, 11,4720–4744.