水凝膠可模擬細胞外基質（ECM）的凝膠狀性質，因而可作為哺乳動物細胞生長和增殖的支持材料。冷凍凝膠（Cryogels）由於固有的相互連接的大孔結構和易於形成的特性，在組織工程和體外細胞培養領域引起了極大的興趣。它們不僅為細胞的三維（3D）組織和開孔形態提供必要的結構，以允許營養供應和廢物代謝產物的去除，最重要的是，相互連通的大孔允許細胞遷移和增殖，有利於血液血管向內生長。澳大利亞墨爾本大學的Andrea J. O'Connor團隊綜述可用於合成生物相容性和生物學相關冷凍凝膠技術和最新進展，介紹物理化學表徵技術，並討論了冷凍凝膠應用的新興趨勢，特別是作為用於細胞培養和組織工程的三維ECM模擬支架。文章以「Cryogels for biomedical applications」為題發表於期刊《Journal of Materials Chemistry B》
1.低溫固化與常規方法生產大孔凝膠
最常見製造大孔水凝膠的方法是依靠水凝膠形成溶液中的物理中斷，中斷在膠凝後去除（圖2a）。物理中斷（稱為致孔劑或成孔單元）在膠凝後被濾出，以形成所需的孔。致孔劑包括鹽，糖，活細菌，二氧化矽和明膠球。這種方法的困難在於去除致孔劑和互連水平不足。用於除去致孔劑的溶劑可能保留在支架內，具有細胞毒性，需要進行大量洗滌以防止或減少對細胞的有害作用。此外，保留在支架中的任何致孔劑都將影響互連，互連是血管向內生長和細胞浸潤的重要考慮因素。因此，需優先使用無毒且易於去除的致孔劑。
低溫法（圖2b）避免了致孔劑，方法簡單。溶劑晶體作為互連的致孔劑可避免諸如細胞毒性之類的問題，將冷凍凝膠簡單地放在高於溶劑凝固點的溫度可實現去除成孔劑。通常，將凝膠溶液冷卻至-5至-20°C。此時很大一部分溶劑會結晶，但一部分凝膠溶液仍保持液態。當溶劑結晶時，水凝膠成分會濃縮在液體微相中，而不是保留在結晶的大相中。在適當的凝膠化時間後，將冷凍凝膠恢復到室溫。隨著溶劑晶體熔化，形成相互連接的大孔水凝膠。當完全水合時，由於在液/孔壁界面處的表面張力，儘管形成凝膠的溶劑晶體是鋒利的，但凝膠的孔變得圓潤。在溶劑結晶過程中，溶劑晶體會一直生長直至前沿與另一個晶體前沿接觸，從而形成高度互連的多孔凝膠。
圖2 （a）經典的大孔水凝膠形成與（b）冷凍凝膠的對比。
2.冷凍凝膠物理性質
冷凍凝膠的物理性質由許多變量決定，包括交聯的程度和類型，凝膠溶液的組成，凝膠化溫度，在該溫度下保持的時間以及冷凍速率。
交聯：低溫凝膠的物理交聯與化學交聯的低溫凝膠略有不同。儘管在給定溫度（例如-20°C）下在溶液存儲期間發生化學交聯，但在解凍階段卻發生了聚合物（例如PVA）的物理交聯。因此，物理冰晶中的交聯度由除霜過程決定，從而更快的融化會導致相對較弱的凝膠。交聯不僅影響凝膠的硬度，而且影響溶脹程度，進而影響凝膠的彈性和機械性能以及水合孔徑。
溫度：在較低溫度下，溶劑結晶更快，導致大量較小的溶劑晶體成核。43由於溶劑結晶的增加，液相微相變得更加濃縮，從而導致孔壁變薄和緻密。膠凝溫度和孔徑之間存在線性關係。
聚合物含量：凝膠的最終孔徑也受聚合物的百分比和分子量的影響。與較大分子量聚合物的凝膠溶液相比，濃度相同的較低分子量聚合物的凝膠溶液導致較大的孔。這些觀察結果與Mark–Kuhn–Houwink方程有關，較高分子量聚合物的溶液由於可結晶的溶液中游離水的含量相對較低而將產生較小的孔。較高聚合物濃度的溶液導致較小的平均孔徑。可以通過增加可交聯基團的使用量、增加交聯和減少游離水的使用量的累積效應來解釋這一現象。與常規水凝膠形成一樣，聚合物含量的增加會增加冷凍凝膠的硬度。
低溫濃縮：冷凍濃度可降低凝膠化所需的臨界濃度，這使得具有低單體含量的凝膠溶液可以在室溫下不會凝固。冷凍濃縮還可以加快膠凝速度，從而在物理和化學交聯凝膠的最佳溫度下，使冷凍凝膠更有效。圖4中表明丙烯醯胺的凝膠聚合的凝膠化時間最短為-20°C，這是由於溶劑的快速結晶和液相微相中凝膠成分的濃縮所致。
圖4 聚丙烯醯胺凝膠形成的時間與環境溫度的關係。實線和點表示與在環境溫度與在低溫條件形成的凝膠。
冷卻速度：為了製造均勻的大孔水凝膠，交聯的速度必須慢於溶劑結晶的速度，否則聚合反應將在沒有溶劑致孔劑的情況下發生，並產生非大孔凝膠。可通過減慢交聯速度以形成晶體和生長來形成較大的孔。最佳的冷凍條件可由給定聚合物溶液的初始溶劑結晶溫度和凝固點溫度來得知。
3.物理表徵
冷凍凝膠組織支架的物理特性（包括局部凝膠力學，孔徑和互連性）會影響培養中的細胞。然而，由於冷凍凝膠的高度水合性質，難以確定結晶的溶劑的體積，進而確定孔壁的最終聚合物組成變得困難，其冷凍凝膠表徵可能會成問題。
孔隙率：冷凍凝膠的孔隙率是通過從溶脹的凝膠中擠出多餘的水，並將其重量（m壓縮的凝膠）與溶脹的凝膠（m溶脹的凝膠）的重量進行比較來確定的。孔隙率≈m溶脹凝膠-m擠壓凝膠/m溶脹凝膠。表徵冰晶凝膠孔隙率的其他技術包括共聚焦顯微鏡，X射線微計算機斷層掃描（μCT），壓汞法，SEM和聚焦離子束（FIB）等。
圖5 （a）用FIB / SEM對多孔明膠水凝膠樣品進行切片和成像，（b）對多孔水凝膠樣品進行3D重建。
機械性能：通過分析穿過樣品的低振幅剪切波，微磁共振彈性成像技術（μMRE）可評估局部損耗和彈性模量的潛力。
4.在組織工程和細胞培養中的應用
表1 列舉用於冷凍凝膠形成的材料和交聯方法
表2 列舉冷凍水凝膠的應用
參考文獻：
doi.org/10.1039/C3TB20280A
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