【科研摘要】
具有海綿狀結構和滲透性的超大孔隙水凝膠因其生物工程和生物醫學應用而備受關注。但是，由於其低密度結構而導致的機械強度不足是其最大的局限之一。剛剛，日本北海道大學水凝膠領域著名專家華裔學者龔建平教授團隊在9月《Chemistry of Materials》刊發了題為『『Preparation of Tough Double- and Triple-Network Supermacroporous Hydrogels through Repeated Cryogelation』』一文。這項工作報告了一種多步冷凍凝膠技術，該技術不需要特殊的設備即可根據雙網絡（DN）策略製備堅韌的超大尺寸水凝膠。所生產的超大型DN凝膠具有相互連接的孔，孔徑為50–230 m。它們還顯示出高達約100 kPa的壓縮模量，比相應的超大型單網絡（SN）凝膠的壓縮模量高2至4倍，在80％壓縮率下的壓縮強度高達1 MPa。超大型雙網絡（DN）冷凍膠凝體也可拉伸，延伸功達38 kJ m-3，比SN冷凍膠凝體大1至2個數量級。高剛度和可拉伸性使它們與其他類型的冰凍膠區別。還製備了由不同聚合物組合組成的超巨三元網絡（TN）凝膠和DN凝膠。該文介紹的技術適用於由各種聚合物製備超大尺寸DN凝膠；因此，在滿足生物工程和生物醫學需求方面很有希望。
【前言】
大多數現存的超大分子水凝膠在機械上是薄弱的。這限制了它們的潛在應用。這種機械缺陷主要是由於兩個原因。首先，材料的機械強度隨著孔的體積分數的增加而降低。孔被認為是散裝材料中的缺陷，通過這些缺陷會引發裂紋。第二，超大尺寸水凝膠通常由單網絡（SN）水凝膠製成，由於缺乏能量耗散機制，它們本質上是弱材料。因此，提高多孔水凝膠機械強度的直接策略是將高強度水凝膠與合適的技術一起使用。
與由SN甚至其他互相網絡（IPN）製成的常規超大尺寸水凝膠相比，衍生自DN凝膠的超大尺寸水凝膠具有更好的機械性能。此外，由於DN效應僅需要對比的DN結構並且不依賴於聚合物的化學種類，因此一旦建立，合成方法也可以應用於需要的各種聚合物，例如生物相容性聚合物。值得注意的是，這種方法可以幫助製備具有開孔形態的DN水凝膠，這使細胞得以增殖，因為這通常具有挑戰性。
超大分子凝膠通常通過幾種方法製備，包括顆粒浸出，溶劑澆鑄，3D列印工藝，氣體發泡，冷凍乾燥和冷凍凝膠法.其中，冷凍凝膠法是最有希望的技術，因為它不需要特殊的設備或使用有毒溶劑。低溫凝膠化涉及在存在作為致孔劑的溶劑晶體（通常是冰）的情況下進行的交聯聚合反應，形成具有高度互連的孔的海綿狀凝膠。在低於溶劑凝固點的某些溫度下，凝膠前體溶液的溶劑形成晶體，而濃縮在溶劑晶體之間的間隙中的凝膠前體通過凝膠化形成凝膠。冰晶膠的孔逕取決於幾個因素，例如冷凍溫度和速率，凝膠前體和引發劑的濃度（如果有）以及樣品模具的大小和形狀。
作者先前還嘗試了製備具有增強的機械性能的冷凍凝膠，例如由兩種相互交聯的聚合物，IPN甚至是DN製成的混合冰晶膠。但是，這些先前關於多孔冷凍凝膠的研究幾乎沒有顯示出改善的機械性能，因為在這些冷凍凝膠中沒有形成DN效應所需的對比網絡結構。此外，多步凝膠化可能導致孔隙結構斷開。這種不連續的孔結構可能是由於使用聚合物前體代替單體而引起的，因為第二次凝膠化的速度比凍結快，因此第二次凝膠化發生在孔中，或者由於單體沒有充分擴散到第一網絡相中。
【圖文解析】
在這項工作中，龔建平團隊建立了兩步冷凍凝膠化方法，以克服這些問題併合成具有高機械韌性和相互連接的孔結構的超大型DN水凝膠。根據DN理論，採用高度溶脹的聚電解質作為第一個網絡，中性聚合物作為第二個網絡。使用兩步聚合過程將這些網絡合併，以形成對比鮮明的雙網絡結構。為了保留第一步冷凍凝膠形成的相互連接的多孔形態，在第二步中控制了冷凍凝膠的形成。然後，使用紫外線引發的聚合反應，以使第二層網絡在第一層網絡的凝膠相中形成，而不是在孔隙中形成（示意圖1）。因此，作者使用常規的DN系統，由聚電解質，聚（2-丙烯醯胺基-2-甲基丙烷磺酸，鈉鹽）（PNaAMPS）作為剛性的第一網絡和中性聚合物聚（丙烯醯胺）（PAAm）製成了超大尺寸水凝膠。柔性的第二層網絡，聚（甲基丙烯酸2-羥乙酯）（PHEMA）和聚（N，N二甲基丙烯醯胺）（PDMAAm）。對這些DN低溫凝膠的多孔結構和力學性能進行了表徵。
示意圖1.用於製備超大型DN凝膠的兩步冷凍凝膠示意圖。
SN冰晶膠的製備
在製備具有相互連通的孔結構的超大尺寸冰晶凝膠期間，聚合必須在冷凍後發生或比冷凍慢。然而，還已知進行聚合有助於系統凍結。因此，決定使用氧化還原引發系統（帶有TEMED的APS）基於PNaAMPS聚電解質網絡製備SN冰晶凝膠。在這種情況下，可以將聚合設置為比凍結慢，並且作者認為，與使用紫外線引發劑相比，樣品更容易且均勻地凍結（輻照前不進行聚合）。冷凍觸發的反應物濃度允許由稀釋的單體溶液製備凝膠。示意圖2中描述了SN冷凍凝膠的製備過程。具體也可參見原文。
示意圖2.DN冷凍凝膠兩步製備，各自的單體結構和樣品編碼的示意圖。
DN和TN冰晶膠的製備
冷凍SN冰晶凝膠後，首先將其冷凍在水中，然後將其預先浸泡在第二單體溶液中，然後通過UV引發的聚合反應合成第二網絡。聚合和凍結速率再次重要。一方面，如果樣品的冷凍速度太快，則原始的SN冷凍凝膠大孔中會形成較小的晶體；另一方面，如果冷凍速度太快，則會形成較小的晶體。這會明顯影響所得的DN凝膠形態。因此，第二層冷凍凝膠溫度應不低於第一層冰晶凝膠溫度。在兩個步驟中都將冷凍凝膠溫度保持相等，即-16°C。另一方面，如果第二網絡聚合比凍結更快，則SN溶脹的SN的原始形態會受到孔內第二凝膠相形成的顯著影響。但是，通過使用光引發劑解決了這個問題。它確保了在樣品冷凍並且冰晶充滿孔後可以引發聚合反應。為了確保DN相的形成，將樣品冷凍後3個小時用UV照射，這樣單體和引發劑就有足夠的時間擴散到SN凝膠相中。示意圖2中描述了DN冰晶凝膠的製備過程。具體也可參見原文。
SN和DN冰晶膠的比較
SN低溫凝膠通常是脆性的，這是通過引入可延展的第二網絡來強化的先決條件。具有4 mol％交聯劑的樣品0.44-4略微不透明（圖1a），而具有1 mol％交聯劑的樣品0.44-1是透明的。有趣的是，超大型水凝膠甚至是透明的。這樣的冰凝膠的凝膠相高度溶脹，使得凝膠相的折射率接近水的折射率。SN冷凍凝膠的（半）透明度可以確保在DN冷凍凝膠的製備過程中具有優勢，因為它可以使紫外線在照射過程中均勻地分布在樣品中。
圖1. SN低溫凝膠0.44-4（a）和選定的DN低溫凝膠0.44-4 / 0.7-0.1（b）的外觀和第一眼機械性能。SN和DN低溫凝膠的SEM圖像顯示了兩組樣品的多孔形態（c，d）以及平衡回水率和孔隙率（e，f）。
冷凍乾燥樣品的SEM觀察表明，在DN低溫凝膠0.44-4和0.44-1系列的第2次冷凍凝膠化後，SN大尺寸小孔（約50–100μm）和相互連接的SN凝膠的原始總體形態得以保持（圖1c，d）。引入第二個網絡後，樣品尺寸僅因溶脹而略有增加。例如，0.44-4/0.7- 0.1樣品直徑從約3.5 mm增加到約3.8 mm，對應於孔徑增加了約9％或按體積的體積增加了約28％。隨著聚合物含量的增加，平衡吸水量（Qw）隨第二單體濃度的增加而降低（圖1e，f）。
DN冰晶凝膠的機械性能
SN冰晶膠和相應的DN冰晶膠的壓縮測試結果分別如圖2a和3b所示。例如，由SN冰晶凝膠（樣品0.44-4）製成的DN冰晶凝膠的壓縮模量比原始SN冰晶凝膠的壓縮模量高約2-4倍（取決於第二個PAAm網絡的濃度）。通過比較壓縮曲線下的面積（圖2a）可以看出，DN冰晶凝膠在壓縮下的韌性也比相應的SN冰晶凝膠強得多。通常，當SN凝膠0.44-4在60％壓縮時的應力達到約15 kPa時，相應的DN凝膠0.44-4 / 1.4-0.1則大於100 kPa。更高的第二網絡濃度導致更高的壓縮模量和更堅韌的DN凝膠。先前有關IPN冰晶凝膠的一些研究表明，多孔凝膠的模量有所增加，但這並不一定意味著強度和韌性的顯著提高。從SN凝膠0.44-1製備的DN低溫凝膠中觀察到了類似的趨勢（圖2c，d）。
圖2.在壓縮（ad）和拉伸（e-h）下測得的DN冰晶膠與原始SN冰晶膠的機械性能。
圖3.以PHEMA作為第二網絡的TN冰晶凝膠（a-d）和DN冰晶凝膠的力學性能和形態
DN冰晶膠的結構分析
為了觀察處於原始溶脹狀態的樣品的結構，DN螢光凝膠0.44-4/0.7-0.1用螢光染料染色，並通過共聚焦雷射掃描顯微鏡（CLSM;圖4a-c）進行可視化。用羅丹明B染色的PNaAMPS 第一層網絡（紅色螢光）和通過與鄰螢光素丙烯酸酯共聚染色的PAAm 第二層網絡（綠色螢光）的圖像顯示出完美的重疊，證實了2網絡主要是聚合的在第一層網絡階段而不是在毛孔中。DN冷凍凝膠0.44/0.7-0.1也用PbNO3溶液處理，從而可以通過納米CT以足夠的對比度可視化腫脹的樣品（圖4d-f）。
圖4.通過CLSM（a-c）可視化腫脹的DN冷凍凝膠0.44-4/0.7-0.1，元件尺寸為（210μm）2×100μm），並通過具有3D分析的納米CT（d-i）進行可視化。
【總結論述】
作者基於DN策略建立了兩步冷凍凝膠化技術，以生產具有開孔形態的堅韌的超大型水凝膠。該技術能夠合成第二網絡，同時保留第一網絡凝膠的多孔結構。當在一定條件下冷凍第二預凝膠溶液時，在孔中優先發生冰的結晶，從而在保持第一網絡凝膠的多孔結構的同時允許第二網絡的合成。研究表明，當引入第二甚至第三網絡時，可以很好地保留第一網絡冷凍凝膠的原始開孔形態。還證明了使用DN/TN策略可以顯著提高脆性超巨細微SN水凝膠的壓縮和拉伸性能。高韌性使DN冷凍膠與常規IPN冷凍膠區別開來。有趣的是，DN冷凍膠還顯示出更好的抗切割性。此外，某些DN冷凍凝膠的半透明性仍可為觀察培養過程中的細胞行為提供優勢。此外，假設雖然所提出的技術可以普遍用於通過冷凍凝膠法製備堅韌的超大型水凝膠，但對於不同的凝膠前體，確切的條件卻有所不同。據悉，本研究中製備的基於PNaAMPS和PAAm的DN冰晶膠是最堅硬的，具有開孔形態的冷凍膠體。這些DN冰晶凝膠將滿足對包括生物醫學領域在內的先進承重應用中對更硬，更強的超巨水凝膠的高要求。
參考文獻：
doi.org/10.1021/acs.chemmater.0c02911
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