上海生科院等建立「類精子細胞」的單倍體細胞系

通過H19-DMR和IG-DMR的敲除，孤雄單倍體胚胎幹細胞可以獲得類似球形精子的特性，以此獲得大量的半克隆小鼠。在此基礎上，可以將這種雙敲的孤雄單倍體胚胎幹細胞運用於獲得多基因敲除和敲入的雜合小鼠。更進一步發現，結合CRISPR-sgRNA文庫，可以一步產生不同的基因突變小鼠。

2012年，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組與徐國良研究組合作從小鼠的精子中建立了孤雄單倍體胚胎幹細胞，並證明這些細胞能夠代替精子使卵母細胞「受精」產生半克隆小鼠，該項研究成果成功入選2012年中國科學十大進展。然而，單倍體細胞隨著體外培養傳代，特別是經過遺傳編輯後，逐漸丟失了產生半克隆小鼠的能力。

　　

2015年7月10日，國際學術期刊《細胞幹細胞》（Cell Stem Cell）在線發表了李勁松研究組的最新研究成果，他們建立了能穩定支持半克隆小鼠出生的「類精子細胞」單倍體細胞系，並證明這些細胞能攜帶CRISPR-Cas9文庫一步產生大量攜帶不同突變基因的小鼠。該成果填補了哺乳動物在個體水平上進行遺傳篩選的空白，為遺傳發育研究提供新的體系。

　　

能代替精子細胞使用的單倍體細胞系的建立為獲取遺傳編輯的動物模型提供了一種新的手段。然而，之前的研究顯示，半克隆小鼠的出生效率低（4.5%左右），而且約一半的半克隆小鼠出現發育遲緩的現象。分析原因發現，原本在精子細胞中不表達的雄性印記基因H19在單倍體細胞和發育遲緩的半克隆小鼠中出現高表達的現象，這暗示印記基因的異常表達可能是導致半克隆小鼠胚胎發育異常的關鍵原因，通過調控印記基因的表達有可能提高半克隆小鼠的出生效率。

　　

為了驗證這一假設，研究人員從H19-DMR敲除的小鼠精子中建立了單倍體細胞系（H19-DMR敲除後，H19的表達下降），發現將這些細胞注入卵子中後能顯著提高半克隆小鼠的出生效率（達到8.7%）。然而，仍然有三分之一的半克隆小鼠出現發育遲緩的現象。進一步分析原因發現，在H19-DMR敲除的細胞和發育遲緩的半克隆小鼠中存在另外一個雄性印記基因Gtl2的異常高表達。為此，研究人員進一步在H19-DMR敲除的單倍體細胞中敲除了調控Gtl2表達的IG-DMR（IG-DMR敲除後，Gtl2表達下降）。令人驚奇的是，H19-DMR和IG-DMR敲除的細胞能高效產生半克隆小鼠，達到22%的出生效率，並且幾乎不會產生發育遲緩的半克隆小鼠。為了進一步驗證這一結果，研究人員在原本已經失去產生半克隆小鼠能力的單倍體細胞中敲除了H19-DMR和IG-DMR後發現細胞又恢復了產生半克隆小鼠的能力，並且能達到17%的效率。這些結果證明，H19-DMR和IG-DMR是單倍體細胞獲得「受精」能力的兩大障礙，將這兩個障礙去除後，能夠產生高效支持半克隆胚胎發育的單倍體細胞。

　　

「類精子細胞」的單倍體細胞系的建立使得利用這一細胞快速製備遺傳編輯小鼠模型成為可能。為此，研究人員先後在H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細胞中進行了多基因的敲除和敲入，建立了攜帶Tet1/Tet2/Tet3三基因敲除、P56/P63/P73三基因敲除以及Tet1-EGFP/Tet2-mCherry/Tet3-ECFP三基因敲入的細胞系，並證明這些細胞能穩定高效支持半克隆小鼠的產生。

　　

最近，CRISPR-Cas9文庫被應用到人和小鼠的細胞中進行了全基因組水平的遺傳篩選。研究人員進一步推測，如果H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細胞能夠攜帶CRISPR-Cas9文庫，讓單個的細胞攜帶一個sgRNA和Cas9核酸酶，通過注入卵子中則可以批量產生攜帶不同突變基因的半克隆小鼠，從而使得小鼠個體水平的遺傳篩選成為可能。通過實驗，研究人員驗證了這一設想，從而填補了在哺乳動物個體水平進行遺傳篩選的空白，為遺傳發育研究提供了新的體系。

　　

鍾翠青、尹奇、謝振飛、白梅竹和董瑞為該文的共同第一作者，李勁松、吳宇軒和中科院-馬普學會計算生物學夥伴研究所的研究員楊力為該文的通訊作者。參與該研究的合作單位和人員包括中科院上海生命科學信息中心研究員李黨生、賓夕法尼亞大學的Bartolomei和劍橋大學的Ferguson-Smith等，工作得到了國家科技部、國家基金委、中國科學院（幹細胞先導專項）以及上海市科委經費的支持。