【實驗方法】明膠酶譜法檢測 MMP 活性

2021-02-23 MDL科研助手

細胞外基質（ extracellular matrix ， ECM ）是由大分子構成的錯綜複雜的網絡。為細胞的生存及活動提供適宜的場所，並通過信號轉導系統影響細胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以降解細胞外基質成份，需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子，是一組具有許多共同生化性質的可降解細胞外基質的酶。基質金屬蛋白酶2（MMP2）主要降解IV型膠原，基質金屬蛋白酶9（MMP9）可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、明膠和纖維蛋白等細胞外基質的成分。基質金屬蛋白酶的失調是多種疾病發生、發展的重要機制之一。

明膠酶譜實驗可以檢測MMP2和MMP9的活性，是分子生物學的常用實驗技術之一。先將樣品進行SDS-聚丙烯醯胺（SDS-PAGE，含0.1%明膠）電泳分離，然後在有二價金屬離子存在的緩衝系統中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復活性，在各自的遷移位置水解凝膠裡的明膠，最後用考馬斯亮藍將凝膠染色，再脫色，在藍色背景下可出現白色條帶，條帶的強弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。

實驗流程如下：

組織或細胞的蛋白樣品製備可用常規的方法，但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA，因為EDTA是金屬離子螯合劑，可以絡合Zn2+，抑制MMP的活性；也不能加入β-巰基乙醇或DTT，因為會導致蛋白的二硫鍵被打開，蛋白不能復性。推薦用PBS或Tris緩衝液（pH7.5）作為蛋白提取的緩衝液，可以加入0.5%的PMSF。

明膠母液配製後可在4℃保存，最好不超過1周。

2)電泳

4℃、常規電泳即可，可以適當延長電泳時間，至溴酚藍完全出膠。上樣量一般為50μg，可根據實驗的具體情況和預實驗結果調整。

①上樣緩衝液中不能加入β-巰基乙醇或DTT，原因同上。

②樣品與上樣緩衝液混合後直接上樣，樣品不要煮沸，高溫會導致蛋白不可逆的失活。

1)將凝膠置於洗脫液（2.5% Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7. 6）中振蕩洗脫2次,每次40分鐘。

2)漂洗液（50mM Tris-HC，5mM CaCl2，1μM ZnCl2）漂洗2次,每次20分鐘。

3)凝膠置於孵育液（50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02% Brij-35）中37℃ 孵育42-48小時。

4)染色液（考馬斯亮藍染色液）染色3小時。

染色液配方表

5)脫色液A、B、C分別脫色（脫色液配方及時間見附表）。

脫色液配方及脫色時間

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