深圳先進院阮長順團隊Biofabrication|基於明膠的可溫度編程和酶固化的高性能生物墨水

2020-10-24 上普生物

具有優異的可列印性，高保真度和出色的細胞存活力的卓越生物墨水的開發仍然是生物3D列印的主要挑戰。近期，中科院深圳先進院的阮長順課題組在Biofabrication期刊上發表了「Temperature-programmable and enzymatically solidifiable gelatin-based bioinks enable facile extrusion bioprinting」的文章，通過使用可逆四氫鍵合的脲基-嘧啶酮（UPy）和酶反應性酪胺部分（Tyr）進行順序化學修飾，使明膠具有可設定溫度的粘度和酶控制的固化，從而實現了增強的可列印性和高保真性。

研究背景

新興的生物列印技術可以精確地排列載有細胞的構建體，以模擬真實的人體組織，這在器官缺損的個體化治療和藥物篩查等方面展示了巨大的潛力。可用於擠出的生物墨水通常具有適當的粘度，以促進三維堆積並同時減少對細胞的損害。同時，還必須在溫和的條件下使其立即固化，以確保高保真度。後固化後，列印的支架也應在生理環境中（例如37攝氏度易發生溶脹變形）保持較高的形狀保真度，並提供合適的基質來支持負載細胞的生長和功能。儘管這些生物墨水特性很重要，但目前並沒有一款完美的生物墨水提供全部相關的性能。

明膠由於其生物相容性，生物降解性和非免疫原性而成為理想的生物墨水。然而，其固有的低粘度和在生理條件下不穩定的物理特性使其不適用於單獨使用列印具有高保真度的組織。在此，研究者通過使用可逆四氫鍵合的脲基-嘧啶酮（UPy）和酶反應性酪胺部分（Tyr）進行順序化學修飾，使明膠具有可設定溫度的粘度和酶控制的固化，從而實現了增強的可印刷性和高保真。

生物墨水設計與評價

UPy能夠形成可逆的四氫鍵，從而在室溫下具有出色的熱響應性能和穩定性。如將UPy單元化學接枝到明膠的骨架上（稱為Gel-UPy），得到具有可編程溫度粘度的Gel-UPy生物墨水，這對生物列印過程很有幫助。另外，一些先前的研究報導酶促交聯可以在溫和的反應條件下實現且具有生物相容性，因此有利於在組織工程支架中使用，尤其是HRP / H2O2。因此，將Tyr部分進一步引入Gel-UPy主鏈（稱為Gel-UPy-Tyr），應在溫和條件下通過HRP / H2O2將其酶交聯以立即固化。由於氫鍵和酶交聯作用增強了分子間網絡，生物列印的載有細胞的Gel-UPy-Tyr構建體應表現出高的形狀保真度和機械穩定性。同時，在生理環境（37℃）下，Gel-UPy-Tyr的酶交聯網絡應提供連續的機械支持以保持形狀保真度，同時應削弱包括分子間三重螺旋和氫鍵在內的可逆鍵合創造一個寬鬆舒適的微環境，以長期改善細胞生長和分化。

圖1. 墨水設計

為了比較明膠基墨水改性前後的力學性能，分別對明膠、Gel-UPy-0.025和Gel-UPy-0.05進行了力學性能評價。結果表明，明膠在壓縮條件下易碎，而Gel-UPy-0.05水凝膠能承受更大的壓縮和拉伸性能。

圖2 墨水特性

Gel-UPy水凝膠具有粘彈性，相比明膠，Gel-UPy水凝膠的模量和延伸率顯著提高，有利於細胞列印的形狀保真度。

圖3 墨水的力學特性

墨水的列印性能

生物墨水的剪切變稀行為有利於材料成形和提高細胞存活率，且Gel-UPy-Tyr可在生理溫度37 ℃下列印。Gel-UPy-Tyr的出絲寬度與針的直徑尺寸高度相似，可在不斷裂的情況下保持其形狀。因此，該材料有構建複雜結構的能力。同時，在37 ℃細胞培養基浸泡2 天后觀察到列印的網狀結構孔隙率保持良好，並保持良好的細胞存活率。酶交聯後Gel-UPy-Tyr墨水中hBMSC的細胞存活率比光交聯後GelMA墨水的細胞存活率高。通過7天培養實驗發現，Gel-UPy-Tyr墨水能顯著促進hBMSC的增殖和展開。


圖4 墨水的列印特性

圖5 墨水的生物相容性


組織結構

研究者進一步列印了一個可逆的，扭曲的，人類真實尺寸的，載有hBMSC的耳朵，一個包含hBMSC和內皮細胞的雙細胞脛骨樣構建體以及一個六邊形稜形的載有肝細胞的支架，顯示了該墨水在複雜組織樣結構生物列印中的巨大潛力。該構建體中的細胞具有90％以上的細胞存活率，並在一周內顯示出增殖和蛋白質分泌，這表明在生理溫度下基於Gel-UPy-Tyr的構建體不僅可以保持高保真度，而且還可以支持加載的細胞的生長和功能。

圖6 組織結構列印能力

總結

研究者開發了一種新型的基於明膠的生物墨水，用於在細胞列印複雜的結構體。在明膠網絡中引入具有四重氫鍵的UPy，賦予了生物油墨以可編程溫度的粘度。因此，UPy修飾的明膠生物墨水可用於通過熱輔助擠出生物列印來構建精確的結構。為了提高可列印性，增強形狀保真度並保持較高的細胞活力，通過改變聚合物網絡中UPy的含量，將明膠生物墨水的粘度調節至合適的水平，以便在生理溫度下進行列印。生物列印後，在溫和的條件下通過HRP / H2O2進行酶交聯以化學固化充滿細胞的複合結構，以進一步穩定結構並確保高形狀保真度。基於研發的墨水，研究者成功創建了各種複雜的組織樣結構，並顯示出高細胞活力，良好的增殖和生物功能。這些明膠基生物墨水具有可設定溫度的粘度和酶促固化有望實現功能性3D組織的構建，並最終形成器官，其未來用途包括從藥物篩選到再生和個性化藥物等方面。

參考文獻

Huimin He, Duo Li, Zifeng Lin, Liuqi Peng, Jirong Yang, Mingming Wu, DelinCheng, Haobo Pan and Changshun Ruan*. Temperature-programmable and enzymatically solidifiable gelatin-based bioinks enable facile extrusion bioprinting. Biofabrication 2020, 12: 045003.（https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab9906）

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