《SCIENCE IMMUNOLOGY》2020年10月發表的一篇美國加州大學的研究報告就正好做出了解釋。
肝轉移可調節全身抗腫瘤免疫，而這些患者CPI抵抗背後的機制基礎還不清楚。以前對肝臟耐受性的研究要麼集中在癌症以外的環境（如傳染病、移植、自身免疫性疾病），要麼就是提示肝轉移前的潛在可能和癌症相關的免疫抑制是基於肝實質範圍內的局部效應。但是這些研究均不能解釋肝臟耐受性對全身或非穩態抗腫瘤免疫的潛在影響，更不能解決臨床上的問題。因此，我們迫切需要了解肝轉移CPI治療失敗的機制，並找出可能提高療效的策略。
一、肝臟腫瘤降低遠處抗腫瘤免疫以及抗PD-1免疫治療的全身反應
圖1
該研究發現，將同基因MC38腫瘤細胞皮下注射給無免疫能力的C57BL/6（B6）小鼠，同時將MC38細胞注射到肝臟或肺部（圖1A），肝臟內腫瘤小鼠的遠處SQ腫瘤的腫瘤生長明顯增加（圖1B）。
既往研究表明，活化標記物PD-1和CTLA-4在CD8+TILs上的高水平表達與腫瘤免疫有關，並預測對CPI有更好的療效。
該研究分析了三組腫瘤浸潤CD8+T細胞表面PD-1和細胞內CTLA-4的表達發現，與患有肺腫瘤的小鼠和對照鼠（僅限SQ腫瘤）相比，攜帶肝臟腫瘤的小鼠的SQ-CD8+TIL上PD-1和CTLA-4表達的百分比顯著降低（圖1C）。
為了驗證抗PD-1免疫治療對該模型的影響，研究者對三組小鼠注射了抗小鼠PD-1單克隆抗體（mAb），發現攜帶SQ和肝臟腫瘤的小鼠對抗PD-1單藥治療不敏感（圖1 D和E），且肝腫瘤小鼠存活率降低和抗PD-1應答率低與肝毒性或肝臟疾病無關功能。從荷肝腫瘤小鼠分離的SQ-CD8+TIL上，PD-1和CTLA-4共表達細胞的頻率顯著降低，CTLA-4和PD-1的平均螢光強度（MFI）較低（圖1F）
二、肝臟促進遠期腫瘤抗原特異性免疫抑制，而不受腫瘤負荷的影響
圖2
為了研究腫瘤負荷的增加是否是免疫抑制的原因，將等量的腫瘤植入不同的宿主解剖部位，以檢測對遠處SQ部位的免疫抑制作用。免疫缺陷型NOD-scid-gamma（NSG）或Rag-1–/−小鼠植入繼發性肝腫瘤後，SQ腫瘤生長沒有顯著差異（圖2B），這表明遠端SQ部位腫瘤生長的調節依賴於適應性免疫。將ir輻射的MC38腫瘤細胞單獨植入腫瘤內腫瘤生長顯著增加（圖2B）。10倍種植-少輻射MC38腫瘤細胞顯示出相似的結果（圖2C）。將一個無關的B16F10腫瘤植入肝臟並不能促進遠處SQ部位的腫瘤生長（圖2D），說明肝臟介導的免疫抑制是腫瘤抗原特異性的。
圖3
三、肝轉移與TILs的表型變化有關
除上述PD-1和CTLA-4外，其他激活標誌物，包括誘導性T細胞協同刺激物（ICOS）和效應細胞因子，也被證明因肝臟腫瘤的存在而改變，並與抗腫瘤反應相關。
在肝轉移小鼠中，CTLA-4、ICOS和幹擾素γ（IFNγ）的表達在分離的CD8+T細胞上顯著降低（圖3 B、C）。而且基於多種激活標記物PD-1、CTLA-4、ICOS和Ki-67的共同表達，大多數高活性T細胞亞群受到的影響最為顯著。常規CD4+TILs在SQ腫瘤內荷肝腫瘤小鼠的ICOS表達較低，但PD-1表達較高（圖3B）。表明傳統CD4+TIL上ICOS的表達與增強的抗腫瘤免疫有關，而PD-1的高表達與抗腫瘤反應的降低相關。
雖然Foxp3+Tregs的百分比和絕對Treg數無顯著差異（圖4 A和B），但肝轉移小鼠的腫瘤組織中PD-1、CTLA-4和ICOS的表達顯著高於對照組（圖3D）。在第二個腫瘤模型B16F10黑色素瘤模型中進行了類似的實驗，觀察到了相似的結果，即小鼠與同種肝腫瘤共同注射後，SQ腫瘤的生長顯著增強，並且降低了激活標記物和細胞因子在與SQ腫瘤相關的細胞毒性T細胞中的表達（圖S5）。
四、Tregs控制肝腫瘤遠處腫瘤免疫的抑制
圖5
大量證據表明，Tregs在肝臟免疫耐受中起著重要作用，並能抑制CD8+T細胞活性和細胞毒性。因此，在Foxp3（FP3-DTR）的控制下，使用表達白喉毒素（DT）受體的小鼠株選擇性地消耗Tregs，以檢測Tregs在系統抑制中的潛在影響。結果表明Tregs參與了肝臟腫瘤特異性抑制（圖3G）。此外，基於ICOS、IFNγ和CD107a表達的顯著增加，Tregs的缺失恢復了腫瘤特異性CD8+T細胞的激活和功能狀態（圖3 H和I）。DT處理組PD-1表達較低。這一結果可能是由於腫瘤負荷減少（由Treg耗竭引起）引起。總的來說，在肝臟腫瘤存在的情況下，Tregs在調節遠處腫瘤特異性CD8+T細胞免疫中起著關鍵作用。
五、Treg缺失或失活逆轉肝臟腫瘤相關的全身免疫抑制
以上結果提示，Tregs可能是抗PD-1單藥治療不能誘導腫瘤消退的原因。因此，該研究使用兩種獨立的方案來選擇性地破壞Tregs，看看它是否能與抗PD-1治療協同作用。結果表明，在抗PD-1單藥無效的肝腫瘤介導免疫抑制中，包括PD-1檢查點阻斷和Treg功能耗竭或破壞的聯合策略可以增強持久的抗腫瘤免疫。
為了驗證Treg耗竭對抗CTLA-4活性，比較兩種藥物的抗腫瘤作用，發現只有Treg缺失的IgG2a抗體能夠在兩個部位實現腫瘤的完全排斥。
肝臟Tregs表型分析和抑制抗腫瘤免疫效應
鑑於Tregs在肝腫瘤模型中的全身免疫抑制中起著重要作用，該研究試圖直接比較有無肝腫瘤的小鼠的體內抑制能力，以確定Treg群體是否存在功能差異。結果表明，肝臟腫瘤的存在誘導了一個高度活躍的Tregs群體，在每個細胞的基礎上更有效地抑制抗腫瘤免疫。
腫瘤中天然免疫細胞的微環境影響抗腫瘤免疫中表達基因和蛋白質
先天性腫瘤微環境中的免疫細胞重編程與抗腫瘤反應高度相關。因此，該研究利用scRNA序列分析了先天性免疫室細胞的轉錄組，發現僅在SQ腫瘤的單核細胞亞群中，表達與免疫抑制相關基因的細胞較少組，包括Socs3、Xbp1、Rhoh、Wfdc17、GOs2和Acod1，表明肝腫瘤誘導的免疫抑制可能是Tregs和MDSC cross-talk的結果。
肝腫瘤相關的Treg控制遠端抗原特異性免疫是由耐受性CD11b介導的MDSCs
以前的研究表明Tregs可以通過改變抗原呈遞細胞（APCs）間接地對效應T細胞產生腫瘤抗原特異性抑制。提示系統性抗原特異性免疫調節機制可能與Tregs和MDSCs相互協調。該研究用14色螢光筆對SQ腫瘤微環境中的髓系/單核細胞/巨噬細胞系細胞進行了觀察，結果發現，肝腫瘤組的兩組細胞CD11b+Ly6G+Ly6C-粒細胞MDSCs（G-MDSCs）顯著增加以及CD11b+Ly6G−Ly6C+單核MDSCs（M-MDSCs）。CD11b+MDSC浸潤增加，CD80/86表達增加，僅在合併肝臟腫瘤的情況下發生，而在其他解剖部位腫瘤並沒有。
對不穩定SQ腫瘤的分析表明，Tregs的耗竭導致浸潤性MDSCs的百分比降低（圖6C）。此外，腫瘤微環境中剩餘的CD11b+單核細胞表達更高水平的CD80/86，提示它們在腫瘤微環境中的功能可能被重新編程為成為能夠向T細胞提供共刺激的APCs（圖6D）。
為了驗證Tregs、CTLA-4和MDSCs的關係，該研究比較了兩種不同類型的小鼠抗CTLA-4抗體克隆9D9。無論是用Treg缺失抗體還是非缺失抗體治療，CD45+CD11b+MDSCs上的CD80/86表達增加；然而，只有Treg缺失IgG2a抗體導致超高壓單核細胞數量減少（圖6，G至I）。類似於反-CTLA-4 9H10抗體，只有Treg消耗IgG2a抗體。當結合抗PD-1抗體治療時，治療能夠在大多數治療小鼠的兩個部位實現腫瘤的完全排斥。因此，雖然CTLA-4阻斷可以恢復MDSCs上共刺激表面CD80/86的表達，但Treg的耗竭可能是進一步阻止任何抑制性MDSCs進入腫瘤微環境的必要條件，並且在存在肝臟腫瘤的情況下實現最大的全身抗腫瘤免疫。
圖6
在腫瘤轉移部位進行的抗腫瘤免疫治療可以顯著降低腫瘤遠處轉移的免疫反應取決於Tregs和MDSCs之間的cross-talk。肝臟繼發性腫瘤導致腫瘤特異性免疫和SQ位點抗PD-1免疫治療反應的顯著抑制。
總之，肝臟腫瘤不僅損害肝內免疫功能，還影響遠期的抗腫瘤免疫，並導致臨床上系統性抗PD-1治療的療效降低。為了揭示導致CPI免疫治療抵抗的潛在耐受機制，本研究利用雙腫瘤免疫活性小鼠模型，發現對肝臟內腫瘤抗原存在的免疫反應導致抗腫瘤的全身抑制免疫。免疫抑制是抗原特異性的，與調節性T細胞（Tregs）的協同激活和腫瘤內CD11b的調節有關。功能失調的免疫狀態可能抗PD-1單一療法不能逆轉，除非Treg細胞被耗盡（抗CTLA-4）或使用zeste2（EZH2）抑制劑增強子的功能性抑制，可恢復全身抗腫瘤免疫和CPI反應。因此，臨床上治療惡性腫瘤肝轉移想要取得更好的療效應該選擇抗PD-1聯合其他靶向治療。
六、臨床上肝轉移的治療展望
儘管在臨床上肝轉移的療效較差，但是與傳統治療或不治療相比較，免疫治療對這部分患者還是能帶來一線希望，比如在KEYNOTE 001、002、006臨床研究隊列亞組分析中，雖然PD-1(帕博麗珠單抗)對黑色素瘤及NSCLC肝轉移患者，均顯示了較差的免疫治療響應，但其緩解率也超過了其他傳統療法所報告的緩解率。結合目前的相關研究，免疫治療的聯合用藥是肝轉移治療的趨勢。
那與化療聯合呢？
IMpower130及IMpower132研究中，肝轉移亞組的患者使用免疫治療聯合化療並未取得顯著的生存獲益。
而聯合化療+抗血管新生呢？
IMpower150研究，肝轉移亞組獲益優於非肝轉移亞組的數據，可能由於抗血管生成藥物與免疫治療藥物具有協同抗腫瘤的作用。
聯合局部治療也是可選擇方案之一，比如立體定向身體放療（SBRT）、經動脈化學栓塞（TACE）等聯合免疫治療在肝轉移患者也能取得一定療效。
目前有PD-L1/CTLA-4雙抗體、PD-L1/TGF-B雙抗體等臨床研究正在如火如荼進行當中，我們也希望這些新的藥物能夠給肝轉移患者帶來更好的療效。