【Flow Cytometry】流式細胞術

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流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上使用流式細胞儀對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。它可以高速分析上萬個細胞，並能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。

流式細胞儀(Flow Cytometor)是一項集雷射技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞螢光化學技術、單克隆抗體技術為一體的檢測儀器。

▌流式細胞儀的組成

1.流動室及液流驅動系統

2.雷射光源和光學系統

經特異螢光染色的細胞需要合適的光源照射激發才能發出螢光供收集檢測。

3.光電管和檢測系統

經螢光染色的細胞受合適的光激發後所產生的螢光是通過光電轉換器轉變成電信號而進行測量的。光電倍增管(PMT)最為常用。

懸浮在液體中分散的經螢光標記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由螢光探測器捕獲螢光信號並轉換成分別代表前向散射角、側向散射角和不同螢光強度的電脈衝信號，經計算機處理形成相應的點圖，直方圖和加三維結構圖像進行分析。

Figure 1: 雷射照射經螢光標記的細胞後，產生了可以檢測的前散射光、側散射光和螢光信號。（圖片來源於網絡）

(1) 散射光信號

前向角散射(Forward Scatter, FSC ) 。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大。

 

側向角散射(Side Scatter, SSC)。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。

(2) 螢光信號

 

自發螢光，即不經螢光染色細胞內部的螢光分子經光照射後所發出的螢光。

 

特徵螢光，即由細胞經染色結合上的螢光染料受光照而發出的螢光，其螢光強度較弱，波長也與照射雷射不同。

自發螢光信號為噪聲信號，在多數情況下會干擾對特徵螢光信號的分辨和測量。

4.計算機和分析系統

經放大後的電信號被送往計算機分析器。

5.細胞分選系統

Figure 2: 不同的細胞經過雷射照射後發出不同的螢光，因而可以對不同的細胞進行分選。（動圖來源於網絡）

分選功能是由細胞分選器來完成。

▌原理

流式細胞術主要是測量單個細胞經適當染色後所發出的散射光和螢光，經染色的細胞在懸液中以單行流過高強度光源的焦點，當每個細胞經過焦點時，發出一束散射光\螢光。它們經過過濾及光鏡系統收集到一個光電檢測器(光電倍增管或一個固態裝置)，光檢測器把散射光定量轉化成電信號，經數字轉換器進行數位化後進行電子存儲，以後數據可以調出顯示和進行分析。

▌細胞的螢光染色

Figure 3: 螢光可以標記在細胞的任何部位。（圖片來源於網絡）

Figure 4: 流式細胞術常用的螢光染料。（圖片來源於網絡）

螢光標記

1.抗原抗體結合。細胞表面的抗原能被經螢光標記的抗體識別。

2.螢光素特異性地結合細胞器和生物大分子

3.生物大分子之間的結合，如PS與AnnexinV的結合

4.通過相互作用引入螢光——酶解底物產生螢光

5.通過代謝不同對細胞進行識別——SP染色

螢光素

1.單分子螢光素

2.耦合的複合螢光素分子

3.新型的納米材料螢光物質—量子點染料Qdots

▌流式細胞儀測定結果

Figure 5: 二維點圖。（圖片來源於網絡）

Figure 6: 二維等高圖。（圖片來源於網絡）

Figure 7: 二維密度圖。（圖片來源於網絡）

結果解讀

1.百分比——目標細胞佔選定細胞群或所有細胞的比例

2.絕對濃度——目標細胞在樣本中的濃度(cells/ul)

3.螢光強度——單個目標細胞上表達某一個蛋白的多少

4.變異係數——所有目標細胞表達某一個蛋白的離散程度

Figure 8: 各種類型的數據顯示方式。（圖片來源於網絡）

FCM數據的存貯採用列表排隊（List Mode）方式，其易於加工處理分析，但缺乏直觀性。數據的顯示通常有一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等幾種（如上圖所示）。

Figure 9: 單參數直方圖。（圖片來源於網絡）

每一個細胞單參數的測量數據可以整理成統計分布，以直方圖的方式來顯示。在圖中，橫坐標表示螢光信號或散射光信號相對強度的值，其單位是道數（channel），可以是線形（line）或者對數（log）。縱坐標一般是相對細胞 / 粒子數（count）。

Figure 10: 二維圖。（圖片來源於網絡）

在二維圖的中，橫坐標 / 縱坐標都表示螢光信號或散射光信號相對強度的值，可以是線形（line）或者對數（log）。雙參數圖可以將樣品細胞群分開，從而直觀、方便的對感興趣的細胞進行分析。

▌應用

流式細胞術不僅可測量細胞的大小、內部顆粒的性狀，還可檢測細胞表面和胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等，在細胞生物學、血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科中廣泛應用。

參考出處：

1.https://baike.so.com/doc/6630138-6843939.html

2.https://www.biomart.cn/experiment/2840.htm

3.https://wenku.baidu.com/view/ec7a8d89680203d8ce2f2498.html

4.https://www.biomart.cn/experiment/430/502/514/515/31660.htm

5.https://www.doc88.com/p-690922946325.html

6.https://www.doc88.com/p-8896851676295.html

7.http://www.doc88.com/p-7488227689468.html

8.http://paper.dxy.cn/article/513968

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