「乾貨分享」神經環路研究工具病毒系列之「順行示蹤病毒」

來源：吉凱基因

神經環路作為大腦運行不同功能的結構基礎，近年來已成為神經科學研究的熱點之一。工具病毒作為高效的表達載體，經過不斷地發展，目前已開發出一系列適用於神經環路研究的工具病毒。如順行示蹤病毒、逆行示蹤病毒、神經環路操控病毒、神經環路記錄病毒等。我們將通過一系列文章詳細介紹不同的神經環路研究工具病毒。本文首先給大家介紹一下神經環路研究中常用的順行示蹤病毒。

目前神經環路研究中常用的順行示蹤病毒如下表所示：

接下來，介紹一些具體的順行示蹤病毒：

1，順行跨多級突觸示蹤病毒-HSV-1-H129

單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）屬於皰疹病毒科、α皰疹病毒亞科，有HSV-1和HSV-2兩種亞型。其中HSV-1型H129毒株具有順行跨突觸的特性（圖1）。

圖1. HSV-H129株特異性順向跨突觸傳播

通過對H129毒株基因組改造，使其攜帶多個螢光蛋白（如GFP、tdTomato、mCherry等）基因拷貝，其感染神經元後表達螢光蛋白並自我複製產生新的病毒顆粒，通過軸突末梢釋放到突觸間隙後經突觸後膜感染下遊神經元胞體，並且表達螢光蛋白，依次重複進而標記出下遊多級神經元。

WB Zeng等人通過對H129改造得到H129-G4，注射小鼠大腦皮層M1區後清晰示蹤出M1區神經元下遊投射（圖2）。

圖2. H129-G4順行標記示蹤神經環路效果圖 （Zeng et al. Molecular Neurodegeneration (2017) 12:38）

2，順行跨單級突觸示蹤病毒

目前常用的順行跨單級突觸示蹤病毒主要有兩種：HSV-1-H129-△TK和AAV1。

HSV-1-H129-△TK 是將HSV-1-H129複製所需的TK基因缺失掉，當感染神經元後，HSV-H129-△TK能夠正常表達螢光蛋白，但因缺乏TK蛋白而無法自我複製，不能傳遞到下一級神經元。當利用腺相關病毒載體在細胞內表達TK蛋白後，病毒獲得自我複製能力，通過突觸結構傳遞到下一級神經元，由於下一級神經元中沒有TK蛋白，因此病毒將不再繼續傳遞下去，因而實現了順行跨單級突觸的標記示蹤（圖3）。

圖3.HSV-1-H129-△TK順行跨單級突觸示蹤原理圖

AAV1即血清型1型的腺相關病毒，Li I. Zhang等人發現給予Ai14小鼠大腦V1區注射高滴度的AAV1-Cre後，下遊 SC、Striatum、LGNv、Pontine等腦區均看到神經元表達tdTomato，提示AAV1-Cre可能跨過突觸在下一級神經元中表達Cre。接著又給予Ai14小鼠視網膜注射AAV1-Syn-Cre，發現在視網膜神經節細胞投射的腦區均觀察到tdTomato陽性的神經元，而這些腦區均無輸出神經元投射到視網膜，因此證明AAV1可以順行跨單級突觸傳遞（圖4）。

圖4. AAV1順行跨單級突觸示蹤神經環路效果圖 （Li I. Zhang，et al., Neuron, 2017）

然而相較於HSV，AAV1的跨突觸效率極低，而且一般僅適用於在下遊神經元表達Cre等重組酶蛋白，無法有效表達螢光蛋白及其它目的基因，因此順行跨單級突觸示蹤優先推薦使用HSV-1-H129-△TK。

3，順行非跨突觸示蹤病毒-AAV9

AAV9感染神經元胞體後可以沿軸突順行標記出神經末梢，但能跨過突觸結構傳遞到下一級神經元。目前被廣泛的用於示蹤神經元下遊直接投射腦區。如圖5，通過注射AAV9示蹤limbic TRN和sensory TRN區PV陽性神經元的下遊投射腦區。

圖5. 利用AAV9示蹤小鼠limbic TRN和sensory TRN區神經元投射腦區（Ping Dong，et al., Nature Neuroscience, 2019）