題目英文：Dissecting the Single-Cell Transcriptome Network Underlying Gastric Premalignant Lesions and Early Gastric Cancer
題目中文：胃癌癌前病變與早期胃癌的單細胞轉錄組網絡解析
發表時間： May 7, 2019 雜誌： Cell Report 影響因子：8.109
摘要英文：Intestinal-type gastric cancer is preceded by premalignant lesions, including chronic atrophic gastritis and intestinal metaplasia. In this study, we constructed a single-cell atlas for 32,332 high-quality cells from gastric antral mucosa biopsies of patients spanning a cascade of gastric premalignant lesions and early gastric cancer (EGC) using single-cell RNA sequencing. We then constructed a single-cell network underlying cellular and molecular characteristics of gastric epithelial cells across different lesions. We found that gland mucous cells tended to acquire an intestinal-like stem cell phenotype during metaplasia, and we identified OR51E1 as a marker for unique endocrine cells in the early-malignant lesion. We also found that HES6 might mark the pre-goblet cell cluster, potentially aiding identification of metaplasia at the early stage. Finally, we identified a panel of EGC-specific signatures, with clinical implications for the precise diagnosis of EGC. Our study offers unparalleled insights into the human gastric cellulome in premalignant and early-malignant lesions.
摘要中文：腸型胃癌的癌前病變包括慢性萎縮性胃炎和腸化生。在本研究中，我們使用單細胞RNA-seq對胃癌癌前病變和早期胃癌(EGC)患者胃竇黏膜活檢組織進行測序，其中32,332個單細胞profile通過質控。然後，我們以不同病變的胃上皮細胞的細胞特徵及分子特徵為基礎構建了一個單細胞網絡。發現腺粘液細胞(gland mucous cells) 傾向於獲得類似腸道幹細胞表型，並且鑑定了OR51E1作為早期惡性病變中獨特的內分泌細胞標記物。我們還發現，HES6可能標誌著杯狀前細胞簇(pre-goblet cell cluster)，可能有助於早期化生的識別。最後，我們確定了一組EGC特異性標誌，對EGC的精確診斷具有臨床意義。我們的研究首次對人胃癌前病變和早期病變的胃細胞組提供了見解。
背景：根據Correa模型，慢性萎縮性胃炎(chronic萎縮性胃炎，CAG)和腸化生(intestinal metaplasia, IM)是腸型胃癌(intestinal type gastric cancer, GC)的主要癌前病變。在癌前病變到惡性病變的過程中，中細胞類型的改變起著至關重要的作用。例如，CAG的特徵是壁細胞（parietal cells）和產生胃蛋白酶原的chief細胞（pepsinogen-producing chief cells）的喪失，而IM則被定義為腸特異性細胞類型的出現，包括杯狀細胞（goblet cells）和腸上皮細胞（enterocytes）。
然而，胃癌前病變和惡性病變胃黏膜中不同類型的細胞的系統描述及其分子特徵尚不明確，這阻礙了我們對其在胃癌發病機制中的作用的研究。
以前的研究使用基於大量樣本的實驗或數學模型來探索GC和癌前階段的分子特徵，掩蓋了不同細胞群的特徵。另一方面，其他依賴於預標記來純化細胞群的研究也僅限於幾種特定的細胞類型，未能充分區分細胞類型，也未能檢測罕見的細胞群或具有特定狀態的細胞。
因此，迫切需要對胃癌前病變和惡性黏膜中單細胞的表達情況進行全面系統的研究。
方法中文：
1.數據：（p8患者取EGC和IM-S，還有同個患者取兩個胃竇活檢）
結果：
1.用Seurat對通過質控的32,332個單細胞進行分群，t-SNE可視化，得到17個細胞群，如下圖。
其注釋標誌來自之前已知的細胞標誌，如下表：
Categories
Cell lineages
Marker genes
Endocrine
G cell
GAST
X cell
GHRL
D cell
SST
Mucous and secretory lineages
pit mucous cell (PMC)
MUC5AC
gland mucous cell (GMC)
MUC6
parietal cell
ATP4A,ATP4B,GIF
chief cell
PGA4,PGA3,LIPF
Immune cells
T cell
CD2, CD3D,CD3E,CD3G
B cell
CD79A,CD19
mast cells
TPSAB1,TPSB2
Macrophage
CD14, CD163, CD68, CSF1R
Stromal cells
Fibroblasts
FAP, PDPN,COL1A2,DCN, COL3A1, COL6A1
Endothelial cells
PECAM1,VWF,ENG,MCAM
Stem cell
stem cell
OLFM4,SOX2,LGR5,CCKBR
Myocytes
Smooth muscule cell (SMC)
ACTA2,ACTN2,MYL2,MYH2
Proliferative cell
proliferative cell (PC)
MKI67,BIRC5,CDK1
Intestinal cells
goblet cell
TFF3,SPINK4,MUC2
enteroendocrine cell
CHGA,CHGB,TAC1,TPH1,NEUROG3
enterocytes
FABP1,CA1,VIL1
2.對兩個已知的在胃炎到胃癌發展中的重要標誌，在細胞群中進行標註，發現炎症微環境中的巨噬細胞在促進胃腫瘤發生中具有關鍵作用。
1）the cytokines and the nuclear factor kB (NF-kB) signaling pathway, respectively, which were known for involving gastritis-induced gastric tumorigenesis.
2）interleukin-1B (IL-1B), whose genotype was reported to confer a greater risk of GC.
3.胃上皮對幽門螺桿菌感染的反應包括整體表達譜的改變和細胞內程序和細胞比例的改變。
9 patients(two H. pylori +, 7 H. pylori - )
4.胃炎發展至胃癌過程中上皮細胞的變化，包括各級病變中特異表達基因富集通路的不同以及細胞比例的變化。
綜合上訴變化以及STRING資料庫的PPI網絡分析，得到一個胃癌癌前病變到早期胃癌的總圖譜，如下圖：
4.接下來，分別對胃炎到胃癌過程中保守的細胞群（Gastric Mucous-Secreting Cell，Enteroendocrine Cell ）以及變化的細胞群進行分析。
在保守的細胞群中，仍有部分細胞有向胃癌發展的趨勢，例如對Gastric Mucous-Secreting Cell進行細分得到cluster1,2，其中cluster 2 特異表達了一些腸道幹細胞或發育相關基因，包括OLFM4, PHLDA1和LEFTY1。
在Enteroendocrine Cell中，胃內分泌細胞標誌主要在IM之前出現，腸內分泌細胞標誌則在IM及之後。
我們觀察到，在EGC病變中，只有12.4%的內分泌細胞表達腸或胃內分泌典型標誌物。因此，不同病變中的內分泌細胞可能以不同的腸內分泌細胞亞型為主。對比內分泌細胞群和其他細胞群，發現差異上調基因中OR51E1 rank 最高，並經過實驗證明OR51E1可以作為早期胃癌內分泌細胞的新標誌。
5.對於在炎癌轉化過程中變化的細胞群，如杯狀細胞，出現在IM中，並且是一個臨床應用的IM病理診斷標誌。對其重分群發現cluster0的上調表達基因主要富集於細胞增殖相關的通路，而另外4個cluster則主要參與代謝相關通路。
偽時序分析發現，cluster0可能是杯狀細胞最先開始出現的標誌，並且發現了一個與常規杯狀細胞標誌聯合達到96%精度的標誌HES6。可能對高風險的non-IM患者有一定的診斷效能。
6.對於在EGC中出現的cancer cell(用CEACAM6等基因注釋)，之前報導過的cancer cell標誌如FABP1，CDH17和GRN並不是特異在cancer cell中表達，而該文章通過單細胞聚類得出的cancer cell類的特異高表達基因，如圖c展示的top 6基因，在TCGA的數據中得到證實：他們都在胃癌相對癌旁normal組織中高表達。
通過選擇那些在癌症細胞中顯著上調但在其他細胞類型中最低表達的基因來定義一組高可信的EGC相關標記基因，並用實驗證明。
7.在用細胞的質心表示每個細胞群，構建了不同上皮細胞類型之間的相關性網絡。發現腫瘤細胞簇顯示出與間質幹細胞簇（MSC）和腸上皮細胞簇（enterocyte ）在轉錄上的最大相似性，這與腸型GC的特徵一致。
討論:
研究也存在一些局限性。首先，當組織被分離進行scRNA-seq測序時，沿著胃腺軸的單個細胞的空間起點丟失了。這一問題可以通過結合雷射捕獲顯微解剖技術和scRNA-seq沿腺體軸解剖不同區域的上皮細胞來解決(Sta˚ hl et al., 2016) 。第二,儘管多個活檢收集從不同等級的病變來模擬不同的損傷級聯從CAG GC，但若在同一病人身上監測從從癌變前的惡性病變到胃癌的發展可能更精確地反映炎導致腫瘤發生的過程。
總之，該研究構建了胃癌前病變和早期胃癌胃黏膜活檢的單細胞轉錄組圖譜。利用圖譜，對不同細胞類型在各等級病變中的表達模式進行了表徵，並分析了它們在各病變中的變化。值得注意的是，該研究發現了一組早期腫瘤細胞特異性標記基因，為準確診斷早期胃癌提供了分子基礎。這個研究結果對不同類型的癌前病變和惡性病變的胃黏膜細胞異質性提供了前所未有的見解，這可能有助於識別早期胃癌的標記物。