kallisto:alignment-free轉錄本定量工具

kallisto 是2016年發布的一款無須比對的轉錄本定量工具，採用了名為pseudo-alignment的算法。傳統的定量算法是根據reads的比對位置來確認其屬於哪個轉錄本或者基因，而pseudo-alignment 算法不關係reads具體的比對位置，而是通過reads的kmer特徵來判斷其屬於哪一條轉錄本，示意圖如下

首先將每個轉錄本序列劃分為kmer, 利用所有轉錄本的kmer序列構建de Bgujin Graph, 簡稱T-DBG，在這個圖中，每個節點是一個kmer, 每條路徑代表一個轉錄本， 由於轉錄本序列的冗餘，實際上每個kmer對應多條路徑，也就是對應多個轉錄本; 然後將測序的reads也劃分為kmer, 並將其映射到T-DBG中。

最終定量時，將該reads的所有kmer對應的轉錄本取交集，就能夠分析出reads可能屬於哪些轉錄本序列。

軟體的官網如下

https://pachterlab.github.io/kallisto/download.html

官網有編譯好的可執行文件，下載解壓即可。代碼如下

wget https://github.com/pachterlab/kallisto/releases/download/v0.44.0/kallisto_linux-v0.44.0.tar.gztar xzvf kallisto_linux-v0.44.0.tar.gz

解壓之後，在文件夾下可以看到名為kallisto的可執行文件。從算法也可以看到，軟體的運行需要兩步，第一步對轉錄本的序列劃分kmer, 構建T-DBG, 也稱之為建索引；第二步對reads 定量。

1. 對轉錄本序列建立索引

kallisto支持讀取gzip壓縮的轉錄本序列，用法如下

kallisto index -k 31 -i hg19.idx  hg19.refMrna.fa

只需要提供轉錄本的fasta格式的序列即可。-k參數指定kmer的長度，-i參數指定輸出的索引的名字，注意kallisto建立的索引為一個文件。

2. 定量

kallisto 支持單端和雙端數據的定量，雙端數據用法如下

kallisto quant -i hg19.idx  -o out_dir  -t  20 \R1.fastq.gz R2.fastq.gz

-i參數指定轉錄本的索引文件，-o參數指定輸出結果的目錄，-t參數指定線程數，kallisto支持gzip壓縮的序列文件。
單端數據用法如下

kallisto quant -i hg19.idx -o output --single -l 180 -s 20 -t 20 reads.fastq.gz

對於單端數據而言，必須指定fragment長度的均值和方差，分別對應-l和-s參數。
在輸出目錄，會生成以下3個文件

├── abundance.h5├── abundance.tsv└── run_info.json

run_info.json 文件為JSON格式，保存了運行的命令和參數。

前綴為abundance 的文件，保存了轉錄本的定量信息。其中h5為HDF5格式的文件，當轉錄本數量較多時，相比純文本，這種格式的文件大小會小很多；tsv為純文本的文件，內容如下

target_id	length	eff_length	est_counts	tpm
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