新晉諾獎得主團隊開發簡易新冠病毒檢測 不用PCR 可手機定量

2021-01-10 健康一線視頻網

根據世界衛生組織（WHO）的統計，在10月8日-10月10日3天時間裡，全球COVID-19新確診患者數目就增加了100萬人。隨著北半球秋冬季的到來，控制COVID-19疫情仍然面臨著嚴峻的挑戰。快速、準確的核酸檢測能夠幫助醫務工作者更早發現受到新冠病毒感染的患者，從而對他們進行治療/隔離和接觸者追蹤。目前的大部分核酸檢測仍然需要將樣本送到專門的實驗室進行處理，往往需要一天，甚至更長時間才能獲得結果，從而可能延誤對患者進行治療和隔離的時間。

因此，科研人員一致在努力開發更快速、更簡便的核酸檢測。使用CRISPR技術加快檢測速度是其中的一個方向。藥明康德內容團隊此前也報導過著名學者張鋒博士率領的團隊和他的合作者們利用CRISPR技術開發簡易新冠病毒檢測的努力。為了讓檢測更為快速、簡便，張鋒團隊的STOPCovid檢測已經經過不斷迭代，不但使用恆溫PCR代替了傳統PCR，而且刪減了純化RNA的過程，還通過優化步驟提高了檢測的靈敏度。

日前，今年諾貝爾化學獎得主之一Jennifer Doudna博士率領的團隊和她的合作夥伴在預印本網站medRxiv上發布了一篇論文，基於CRISPR-Cas13a技術開發了一種新型新冠病毒檢測。這款檢測與眾不同之處在於它不需要對病毒RNA使用RT-PCR進行擴增，可以直接定量檢測樣本中的病毒RNA水平。研究人員還開發了一款基於智慧型手機相機的檢測系統，讓醫務人員不需要複雜的儀器，就可以在實驗室以外的環境中讀出檢測結果。

不用PCR，提高CRISPR檢測的靈敏度

這一檢測的核心原理並不難理解。研究人員使用一種叫做Cas13a的酶和與之相結合的CRISPR RNA（crRNA）構成一個複合體。當crRNA與病毒RNA上的特異性序列相結合之後，能夠激活Cas13a酶。Cas13a是一種很有趣的酶，一旦被激活，它就會不分青紅皂白地切開周圍所遇到的任何其他單鏈RNA分子。利用這種特性，研究人員們在樣本裡還會添加一種通過RNA相連接的螢光分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會被切斷，釋放出能夠發出螢光的螢光分子。這樣通過讀取螢光信號，就可以檢測到病毒特異性序列的存在。

以前基於這一原理的CRISPR檢測為了提高檢測的靈敏度，都要對樣本中的RNA通過PCR進行擴增。然而這一PCR步驟不但增加了檢測所需的時間，也意味著檢測數量會受到PCR試劑供給的限制。

▲使用多個靶向不同病毒序列的crRNA能夠提高檢測靈敏度（圖片來源：參考資料[2]）

在這項研究中，研究人員採用了另一種方法提高檢測的靈敏度。他們推測，既然一個跟病毒特異性序列結合的crRNA能夠激活Cas13a酶的活性，那麼兩個跟不同病毒特異性序列結合的crRNA是否就能更快地激活Cas13a酶的活性，讓螢光信號的上升速度變得更快呢？

實驗也證實了他們的假設。當研究人員使用兩種不同的crRNA激活Cas13a酶時，雖然總共的crRNA水平沒有變，但是螢光信號的增長速度明顯提高了。通過檢測螢光信號的增長速度而不是螢光信號的絕對值，他們發現使用兩個crRNA能夠顯著提高檢測的靈敏度。當使用一個crRNA時，檢測的靈敏度達到10，000個病毒拷貝/微升，而使用兩個不同crRNA時，靈敏度提高到低於1000拷貝/微升。

為了進一步提高檢測的靈敏度，研究人員開發了包含3個靶向新冠病毒不同特異性RNA序列的crRNA的檢測手段，在檢測5個COVID-19患者鼻咽拭子樣本的實驗中，這一檢測準確地發現了這5個陽性樣本，而且螢光信號增加的速度與輸入樣本中的病毒拷貝數有很好的線性關係，進一步證明這一檢測可以用於定量測量病毒水平。

利用智慧型手機的相機構建簡易信號讀取系統

為了證明這一簡易檢測能夠在實驗室以外的環境中使用，研究人員基於智慧型手機的相機構建了一個簡易的螢光信號檢測系統。令他們意外的是，這個基於手機相機的螢光信號檢測系統的靈敏度竟然比實驗室裡使用的商業化讀板器（plate reader）高出一個數量級。使用這款簡易螢光信號檢測系統，研究人員只需5分鐘就能判斷出5位COVID-19患者的鼻咽拭子樣本為陽性。

▲基於智慧型手機相機設計的螢光信號讀取系統（圖片來源：參考資料[2]）

研究人員在討論部分指出，如今智慧型手機不但很普及，而且它們的相機靈敏度都很高。更重要的是智慧型手機通常都攜帶GPS並且可以聯網。這讓將讀取的結果傳輸到雲端資料庫，協助接觸者追蹤變得更為簡便。基於智慧型手機的新冠病毒檢測系統可能在控制目前和未來的大流行方面起到重要的作用。

參考資料：

[1] New test detects coronavirus in just 5 minutes. Retrieved October 12, 2020, from https://www.sciencemag.org/news/2020/10/new-test-detects-coronavirus-just-5-minutes

[2] Fozouni et al., Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone. medRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947

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