高通量測序(又名下一代測序, NGS)的原理簡介

2021-01-16 四川病理

高通量測序（High-Throughput Sequencing）又名下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS），是相對於傳統的桑格測序（Sanger Sequencing）而言的。目前高通量測序的主要平臺代表有羅氏公司(Roche)的454測序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer）。

454公司首選將焦磷酸測序應用在測序技術上，之後便被羅氏診斷收購，形成了目前的Roche 454。待測DNA樣品被打斷成300-800bp的片段後，3' 和5'端分別加上接頭，這些接頭會使DNA片段結合到微珠上。測序PCR反應就發生在固相的微珠上，並且整個PCR反應和相關的酶被油包水的液滴包裹，每個油滴系統只包含1個DNA模板。擴增後，每個DNA分子可以得到富集，每個微珠只能形成一個克隆集落。454測序儀的測序通道體積非常狹小，只能容納一個微珠。測序過程中，GS FLX系統會將引物上dNTP的聚合與螢光信號釋放偶聯起來。通過檢測螢光信號，就可以達到DNA測序的目的。相對於Sanger測序，Solexa和Solid測序而言，454可以提供中等的讀長和適中的價格，適合de novo 測序、轉錄組測序、宏基因組研究等。

Solexa的測序原理是可逆終止化學反應。DNA片段加上接頭之後，可以隨機的附著於玻璃表面（Flow cell），並且在固相的表面經過橋式擴增。這樣就形成了數千份相同的單分子簇，被用做測序模板。測序採取邊合成邊測序的方法，和模板配對的ddNTP原料被添加上去，不配對的ddNTP原料被洗去，成像系統能夠捕捉螢光標記的核苷酸。隨著DNA 3'端的阻斷劑的去除，下一輪的延伸就可以進行。和焦磷酸測序不同，每次DNA的只能延伸一個核苷酸。Solexa的讀長在100-150bp之間，適合小RNA鑑定、甲基化和表觀遺傳學研究。

ABI Solid技術的核心是4種螢光標記寡核苷酸的連接反應測序。測序之前，DNA模板通過乳化PCR擴增，和Roche 454的基本相同，只是Solid的微珠更小，只有1μm。3'端修飾的微珠可以沉澱在玻片上。連接測序所用的底物是8個鹼基螢光探針混合物，根據序列的位置，樣品DNA就可以被探針標記。DNA連接酶優先連接和模板配對的探針，並引發該位點的螢光信號的產生。Solid的讀長只有50-75bp，精確度可達Q40，適於基因組重測序和SNP檢測。

三個廠家的高通量測序儀器雖然各具特點，在原理上很多的共同之處：

1 將目標DNA剪切為小片段

2 單個小片段DNA分子結合到固相表面

3 單分子獨立擴增

4 每次只複製一個鹼基（A,C,T,G）並檢測信號

5 高解析度的成像系統

高通量測序以其高輸出量與高解析度的特性，不僅為我們提供了豐富的遺傳學信息，而且使得測序的費用和時間大大縮短。在高通量測序發展的過程中，也有很多的問題需要我們去解決：數據在臨床診斷上的作用，測序數據的儲存和分析，數據的安全和信息隱私等。

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  • 什麼是基因測序?
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