NGS測序技術原理,檢測方案及選擇標準大全!

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測序技術的發展主要基於兩個非常具有裡程碑意義的理念：「生命是序列的」和「生命是數據的」。序列是基因組學最基本最重要的數據，也是生命科學領域大數據時代的核心組成部分。簡單來說，測序技術就是將DNA/RNA分子中鹼基ATGC的排列順序顯示出來！

1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構。

DNA雙螺旋模型以及「生命是序列的」觀點的發表，直接推動了測序技術的發展，因為解讀生命遺傳信息的前提就是得到它的載體——序列。

從20世紀70年代到現在有很多測序技術和平臺的產生，其中包括SBC法、454、Ion Torrent、SBL法、Sanger法、Illumina、Pacbio、Nanopore等。今天主要跟大家分享後四種常用的測序技術。

Sanger法是基於DNA合成反應的測序技術，又稱為SBS法、末端終止法。1975年由Sanger提出，並於1977發表第一個完整的生物體基因組序列。

核心原理：由於雙脫氧核苷酸(ddNTP)的3』位置脫氧，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應，在4個DNA合成反應體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影，根據電泳帶的位置確定待測分子的DNA序列。

在每個反應體系中，ddNTP相對於dNTP是很少的，所以只有部分新鏈在不同的位置特異性終止，最終就會得到一系列長度不一的序列。

以Illumina平臺為代表的第二代測序技術實現了高通量測序，有了革命性進展，使得大規模並行測序成為現實，極大推動了生命科學領域基因組學的發展。Illumina循環SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆終止)的核心技術是DNA合成的可逆性末端循環，即3'-OH可逆性的修飾和去修飾。

基本原理：將dNTP的3'-OH以疊氮集團RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基團)進行修飾；將4種鹼基分別與不同的螢光分子連接；DNA合成時，RTG能起到類似於ddNTP的作用終止反應；每次合成反應終止並讀取信號之後，洗脫RTG和螢光分子，進行下一輪循環。

主要過程：

a, DNA待測文庫構建

利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，並在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構建出單鏈DNA文庫。這些文庫中的DNA在通過flowcell(吸附流動DNA片段的槽道)時會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對，並能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增。

b,c 橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增。經過不斷的擴增和變性循環，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多份拷貝，進行這一過程的目的在於實現將鹼基信號強度放大，以達到測序所需的信號要求。

測序方法採用邊合成邊測序的方法：

1. dNTP模型

2. dNTP加上可終止反應的基團RTG和螢光信號

3. 反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有鹼基特異螢光標記的4種dNTP

4. 脫掉-OH和二磷酸，進行合成

5. 反應因RTG終止，激發螢光進行信號採集。

6. 洗脫RTG和螢光分子，進行下一輪循環

以Pacbio平臺為代表的SMRT(Single-Molecule Real Time Sequencing,單分子實時測序)測序技術具有高通量、長讀長的特點。

基本原理：Pacbio仍然採用邊合成邊測序的原理，但實現了兩個重要的技術突破。一個是將螢光分子標記在磷酸上，這樣在反應停止且捕獲螢光信號以後，可直接隨磷酸基團脫落，解決了因噪音汙染導致的讀長很短的問題；二是由於不需要PCR擴增，信號的有效提取成為了關鍵。通過引入零模波導孔（ZMW）技術解決這一問題。在納米室底部有一個孔徑70nm的小孔，由於遠遠小於雷射的波長，所以雷射從底部照射時，只會照亮一個小的區域，提高了信噪比。

主要過程：如下圖所示，類似於Illumina部分展示的模式圖，也是邊合成邊測序。

納米孔測序技術是單分子實時測序的新一代技術，主要是通過ssDNA或RNA模板分子通過納米孔而帶來的「電信號」變化推測鹼基組成進行實時測序。

基本原理：當納米孔充滿導電液時，兩端加上一定電壓，分子模板通過納米孔生成可測量電流。納米孔的直徑只能容納一個核苷酸，單鏈模板就會在電場作用下依次通過納米孔而引起電流強度變化，通過檢測相應的電流峰判斷鹼基，實現實時測序。

單基因測序和高通量測序Choy KW. N Engl J Med.2019 .

今天隆重介紹的就是當下測序的主要檢測技術——高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS），該技術可以實現多基因大規模平行測序，可以從根本上解決單基因遺傳病因異質性、基因多、表型複雜造成診斷難的實際問題。NGS實驗流程是一個文庫製備→晶片捕獲→測序→數據分析的過程，基於NGS測序技術有三類檢測方案：

各檢測方案示意圖（Klein CJ.et.al. Mayo Clin Proc.2017）

一、NGS-目標疾病類捕獲方案（Panel方案）

Panel檢測是針對某一特定類別疾病的相關基因，如下圖-中圖：

各檢測方案示意圖（Klein CJ.et.al. Mayo Clin Proc.2017）

Panel檢測適用於以下幾種情況：

（1）基因研究清楚的特定表型的診斷。如遺傳性痙攣性截癱、腦白質營養不良、CMT等。

（2）重疊疾病表型的診斷。如肌病Panel，雖有重疊表型，但又屬於不同疾病類，可用不同Panel檢測。再如癲癇，遺傳代謝病引起的代謝性癲癇和幼嬰癲癇性腦病均以癲癇為主要表現，分屬不同類別，且有各自表型特點，也應採用不同Panel檢測。

（3）屬於同一類致病機制或分子途徑的疾病。如離子通道病神經系統疾病進行Panel檢測。

Panel檢測技術優勢：檢測基因數目少，使檢測成本相對低，數據分析速度快，整體檢測周期短。另一顯著的優勢，在蛋白編碼區域能達到很深的測序深度與覆蓋度，這對臨床診斷來說至關重要，因為高深度意味著準確率高。Panel檢測因為是對已知基因進行目標基因檢測，最大的局限性就是只能檢測Panel內的基因。如果疾病致病基因不在Panel裡則不會被檢測到，隨著疾病的新的致病基因被發現，或對非典型表現的認識程度加深，有些Panel可能會因為基因不全而應用受限，這就需要再重新設計Panel。

二、NGS-全部外顯子組捕獲方案（WES方案）

全外顯子組檢測（Whole Exome Sequencing，WES）（上圖-左），WES檢測不局限於特定選擇的基因，範圍是人類已知20000多基因的編碼區序列，大概是整個基因組的1-2%，但卻包含了基因變異的85%。因此，WES檢測是在已知基因下針對SNVs這種變異最全面的方案。據研究統計，孟德爾遺傳病通過WES檢測的陽性率可以達到22%至31%。神經系統疾病用WES檢測診斷陽性率（30.6%）比非神經系統遺傳病陽性率（如：皮膚系統17.2%、血液系統疾病17.1%）更高。用WES方案檢測癲癇或共濟失調可以達到總體36.1%的陽性率。

不同表型應用WES方案的陽性檢出率（Wright CF et.al. Nat Rev Genet. 2018.）

WES檢測適用於：

（1）表現為遺傳異質性疾病的診斷。如自閉症或發育障礙、線粒體疾病，這類疾病常涉及多種表型系列，且致病機制複雜。

（2）一個患者表現出兩種或以上的完全獨立系統疾病的複雜情況。如：患者既有眼皮膚白化病又有中性粒細胞減少又有癲癇表現，這樣患者選擇方案時選兩個或兩個以上的Panel反而會增加成本。

（3）患者全身多系統受累。如：一些症候群類疾病，像Kabuki症候群，表現為特殊面容、骨骼發育障礙、多發畸形等。或Zellweger症候群，表現全身多發畸形、神經系統症狀、肝功能和腎功能異常等多種表現。

WES檢測優勢是全面，是對全部基因的外顯子進行檢測。相比於Panel，會有更大的發現新致病基因的可能性。可以檢測到編碼區的VUS變異，用於人類基因組外顯子研究非常重要。WES最大的挑戰就是數據分析，WES通常有150-200×的測序深度，平均測序深度不低於100×，並且20×深度的基因覆蓋度也是數據質量可靠的重要參考指標。

三、NGS-全基因組測序方案（WGS方案）

全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）檢測範圍最全面，不用捕獲，是對整個基因組進行檢測，不僅能檢測編碼區，還可以檢測到非編碼區以及調控區，以及一些結構變異。但WGS的局限性也是顯而易見的。首先，因WGS是對整個基因組檢測，會檢測到很多內含子和基因間區域內變異，而這些變異的功能在很大程度上是未知的，因此這些被檢測的未知數據的分析解讀是一個難題。其次，如果保證數據深度（100×）和質量的條件下，WGS會比WES高於3-5倍甚至更高的檢測成本。第三，由於數據量的增多，在數據存儲、數據分析、數據過濾注釋等方面需要建立的方法都要比WES更加複雜。最後，WGS無大樣本罕見變異參考，即使檢測到的數據，也可能無致病性分析的參考。

檢測方案的選擇要從患者實際患病情況出發，為患者選擇最適合方案以達到精準診斷的目的。有兩點選擇標準：

一、表型越非特異越應選擇相對全面的方案

表型異質性與特異性示意圖（Wright CF et.al. Nat Rev Genet. 2018.）

當一個疾病表型很確定時，只需要選擇相對明確的直接檢測，如圖，假如能確定囊性纖維化，只檢測CFTR基因即可，應用NGS測序都已屬於過度檢測。而對於一些非特異性的我們也稱為遺傳異質性表型，為達到更高陽性檢出率必須做相對大而全的方案。

二、Trio模式比先證者模式檢測更嚴謹

不同檢測方案的陽性率統計（Wright CF et.al. Nat Rev Genet. 2018.）

先證者模式是只對家系中第一個發現該病的患者（先證者）一個人進行檢測，數據分析後有疑似致病性位點，再進行父母或其他患病成員的家系Sanger測序驗證。家系模式是對先證者及其父母三個人全部進行NGS測序。Trio模式會提高陽性診斷率，如嚴重發育障礙患者，先證者模式WES陽性診斷率是28%，Trio-WES的陽性診斷率可以提高至40%，增加了12%的陽性診斷率。這是因為家系模式可以從遺傳學上考慮見到更有意義的變異位點，如：De novo突變、純合突變、複合雜合突變、X連鎖疾病半合子突變、單親二倍體、家系表型-基因型共分離，通過家系篩查可以判斷變異致病性，有更強的遺傳學證據，同時避免出現先證者模式可能造成的假陽性結果。

隨著近年來高通量測序技術的發展，以及測序成本的降低，高通量測序技術已逐步替代經驗診斷為主導的單基因測序技術，成為遺傳病診斷的主要遺傳學檢測技術。基於高通量測序技術平臺，衍生出不同的檢測方案。不同檢測方案均有其檢測適應症、優勢及局限性，在方案選擇上要充分考慮患者臨床表型，以及疾病與基因相關性進行綜合評估，選擇能夠為患者帶來最好診斷效果的檢測方案。當下測序技術本身已不是瓶頸，核心關鍵在於高通量測序後得到的海量數據的數據分析與數據挖掘。運用高通量測序技術，結合生物信息學分析、遺傳學分析、臨床表型分析等進行多學科綜合分析與解讀，最終實現對單基因遺傳病患者進行精準病因學診斷。

來源：知乎，生信空間

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