Cell|全基因組篩選揭秘內質網自噬分子調控機制

撰文 | 十一月

細胞自噬會介導細胞內的物質被帶到溶酶體中進行降解，這對於維持細胞內的穩態非常關鍵。通過自噬特異性地移除整個細胞器也是對細胞穩態的保護。以線粒體為例，破損的線粒體表面上的蛋白會被磷酸化和泛素化修飾標記，從而招募自噬相關的蛋白特異性地進行線粒體自噬（Mitophagy）【1,2】。

選擇性細胞器自噬的失調會對細胞適應性產生負面影響，且與神經退行性疾病的發生和發展息息相關。舉例來說，線粒體自噬相關基因如PINK1和Parkin發生突變會造成人體產生帕金森等疾病的發生【3,4】。

內質網在體內多種生物學過程中都擔綱重要角色，比如鈣的存儲、脂質的生物合成、分泌蛋白和膜蛋白的成熟和運輸等方面都離不開內質網的正常運轉【5】。內質網自噬（Autophagy of the ER, ER-phagy）的研究其實最早在開始於15年前，是在酵母中進行的研究【6】。

而一直到近年來關於內質網自噬的研究才在哺乳動物細胞有所進展【7】（所以各位研究生小白們不要著急，令你揚名立萬的科學研究現在可能還處在「幼兒園」萌芽階段）。但關於內質網自噬的相關調節信號通路的研究還並不非常清楚。

2020年3月10日，加州大學伯克利分校Jacob E. Corn研究組在Cell上發表文章A Genome-wide ER-Phagy Screen Highlights Key Roles of Mitochondrial Metabolism and ER-Resident UFMylation，針對內質網自噬以ER-phagy報告基因為篩選背景展開了全基因基礎的篩選，發現並鑑定出200多個與人類內質網自噬相關的因子，揭開了內質網自噬依賴於UFM1類泛素化類似修飾蛋白信號通路的相關分子機制。

為了揭開內質網自噬調節相關的信號通路，作者們進行了一個全基因組CRISPR幹擾(CRISPRi)為基礎的篩選。記得北京生命科學研究所的王曉東老師曾經說過：「if you run out of idea, do a screen」(另一個流傳的版本是，邵峰老師曾說過的，「當研究沒有什麼頭緒的時候，就去做個篩選吧」)。篩選這條路子幾乎百用不廢，通過大規模的篩選科學家們可以得到一個與研究目標相關的一個寶庫。而通過篩選得到的靶標基因或者藥物等的方式所具有的系統性、廣泛性是其他實驗所不能比擬的。

一個好的篩選方案需要具備哪些特點？首先，有一個可靠的篩選背景，比如篩選報告基因、篩選細胞品系；其次，有良好的實驗對照（空白對照、陰性對照與陽性對照）；最後，篩選結果有明確的可讀性，比如通過報告基因螢光數值變化、細胞存活數量計數、產生反應顏色等等。當然，為了確保實驗的順利進行，在進行大規模篩選之前可以進行一個小規模的預實驗，對實驗系統進行檢測和確認。

作者們以2018年發表的一個內質網自噬串聯報告基因系統（ER-autophagy tandem reporter system，EATR）【8】進行全基因組篩選（圖1）。在細胞中穩定表達藥物誘導的EATR質粒，其中包括mCherry和eGFP兩種連接在內質網定位蛋白之上。在細胞質中，細胞內的pH值表現為中性，可以觀察到由內質網定位蛋白mCherry和eGFP的同時表達出現黃色信號。

而在溶酶體中，其環境為偏酸性，此時eGFP淬滅因而只表現出紅色。dCas9-KRAB質粒在細胞中的穩定表達是為了確保sgRNA靶向基因的轉錄抑制（圖1）。通過篩選，作者們找到了與內質網自噬相關的約200個基因。

通過Gene ontology分析，作者們發現，與內質網自噬相關的基因主要可以分為以下幾個類群：自噬執行相關基因；泛素化修飾；線粒體代謝與氧化磷酸化相關的基因；泛素類似蛋白UFM1相關的蛋白翻譯後修飾相關基因。

圖1 內質網自噬報告基因篩選系統

作者們驚訝地發現，很多與內質網自噬相關的蛋白都是氧化磷酸化過程相關因子。因此，作者們希望找出內質網自噬與線粒體代謝過程之間的聯繫。通過遺傳學敲低氧化磷酸基因或者化學藥物施用破壞氧化磷酸化過程，作者們發現線粒體的氧化磷酸化過程可以促進內質網自噬。另外，使作者們非常驚訝的是通過敲低氧化磷酸化組分引發的內質網自噬減少並不依賴於AMPK信號通路。

除了與線粒體代謝相關的因子之外，作者們還篩選到了一些定位在內質網或者與內質網功能相關的一些因子，其中就包括與內質網穩態相關的DDRGK1【9】。作者們通過免疫染色實驗發現DDRGK1與內質網共定位。

而且之前有研究表明，DDRGK1可以被通過類泛素化蛋白UFM1修飾，對於其他因子的進一步UFM1修飾也是非常關鍵的【10】。UFM1類泛素化修飾包括激活、結合和連接過程，與泛素化過程類似，UFM1修飾也需要E1（UBA5）、E2(UFC1)和E3（UFL1）的參與（圖2）。

而且DDRGK1的UFM1修飾也依賴於其存在的賴氨酸（K）位點。通過生化實驗，作者們的確發現內質網自噬過程中DDRGK1會發生UFM1修飾，但是在敲除了UFM1後，DDRGK1的表達豐度未受影響，敲除E3連接酶UFL1之後也不會對此修飾的水平造成影響。突變DDRGK1中所有保守的賴氨酸位點也不會影響其與E3連接酶UFL1之間的相互作用。

這些結果讓作者們意識到一點，DDRGK1未必是內質網自噬過程中UFM1修飾的靶點，而可能是作為E3連接酶UFL1適配器（Adaptor）而非底物發揮作用的。通過實驗作者們發現，DDRGK1通過其中一個結構域在內質網自噬過程中招募E3連接酶UFL1到內質網上激活UFL1連接酶的活性，對其內質網自噬相關的底物進行UFM1修飾。

圖2 UFM類泛素化修飾過程

總的來說，Jacob E. Corn研究組的工作通過全基因組CRISPRi為基礎的篩選找到了200個與內質網自噬相關的基因，為今後對於內質網自噬相關過程以及相關疾病的研究提供了重要的資料庫。同時，作者們發現了一條DDRGK1依賴的、UFM1類泛素化修飾相關的內質網自噬相關信號通路，進一步豐富了關於內質網自噬方面的研究（圖3）。

圖3 全基因組篩選揭示出內質網自噬分子機制模型圖

製版人：珂

參考文獻

1. Youle, R. J. & Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy.Nat Rev Mol Cell Biol12, 9-14, doi:10.1038/nrm3028 (2011).

2. Nguyen, T. N., Padman, B. S. & Lazarou, M. Deciphering the Molecular Signals of PINK1/Parkin Mitophagy.Trends Cell Biol26, 733-744, doi:10.1016/j.tcb.2016.05.008 (2016).

3. Dodson, M. W. & Guo, M. Pink1, Parkin, DJ-1 and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.Current opinion in neurobiology17, 331-337, doi:10.1016/j.conb.2007.04.010 (2007).

4. Deas, E., Wood, N. W. & Plun-Favreau, H. Mitophagy and Parkinson's disease: the PINK1-parkin link.Biochimica et biophysica acta1813, 623-633, doi:10.1016/j.bbamcr.2010.08.007 (2011).

5. Schwarz, D. S. & Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: structure, function and response to cellular signaling.Cell Mol Life Sci73, 79-94, doi:10.1007/s00018-015-2052-6 (2016).

6. Hamasaki, M., Noda, T., Baba, M. & Ohsumi, Y. Starvation triggers the delivery of the endoplasmic reticulum to the vacuole via autophagy in yeast.Traffic6, 56-65, doi:10.1111/j.1600-0854.2004.00245.x (2005).

7. Khaminets, A. et al. Regulation of endoplasmic reticulum turnover by selective autophagy.Nature522, 354-358, doi:10.1038/nature14498 (2015).

8. Liang, J. R., Lingeman, E., Ahmed, S. & Corn, J. E. Atlastins remodel the endoplasmic reticulum for selective autophagy.J Cell Biol217, 3354-3367, doi:10.1083/jcb.201804185 (2018).

9. Leto, D. E. et al. Genome-wide CRISPR Analysis Identifies Substrate-Specific Conjugation Modules in ER-Associated Degradation.Mol Cell73, 377-389 e311, doi:10.1016/j.molcel.2018.11.015 (2019).

10. Liu, J. et al. A critical role of DDRGK1 in endoplasmic reticulum homoeostasis via regulation of IRE1alpha stability.Nature communications8, 14186, doi:10.1038/ncomms14186 (2017).