專訪李勁松博士:人造精子孕育"女兒國" 破解出生缺陷基因

 

 

 

在剛剛過去的世界出生缺陷日（3月3日），世衛組織官網披露全球每年超過800萬嬰兒患有嚴重出生缺陷。剔除圍產期環境因素和孕婦妊娠期用藥不當等原因，絕大多數先天性缺陷都源於顯性/隱性基因異常。因此明確親代致病基因位點與遺傳疾病的關聯，對於孕前早期篩查的一級出生缺陷防控體系而言至關重要。

神經管異常是我國常見的重大出生缺陷之一，其中遺傳因素貢獻度高達70%。復旦大學王紅豔課題組與中科院生化細胞所李勁松課題組合作，利用「人造精子」技術培育全雌性半克隆小鼠，僅耗時半年就成功驗證神經管畸形的強致病基因位點。那麼與傳統二倍體基因組發育而成的模式動物相比，單倍體胚胎幹細胞發育而成的小鼠有哪些特殊的研究優勢？又將為重大遺傳病研究和細胞重編程發展產生怎樣的強大助推力？讓我們到李勁松博士團隊培育的特殊「女兒國」中一探究竟！

半克隆小鼠，快速鎖定遺傳缺陷基因

Q：人造精子技術在神經管缺陷的致病基因篩查中，如何實現其快速優勢？

李勁松博士：神經管是胚胎的中樞神經系統，神經管異常之後會使胚胎產生無腦、腦部膨脹、脊柱裂、唇顎裂等症狀。王紅豔課題組在神經管畸形和正常對照樣本中，篩選了數個潛在致病突變位點。我們團隊將突變位點逐一敲入人造精子，分別培養出含有這些候選突變位點的小鼠細胞系，最後我們鎖定了一系列基因位點的雜合突變會導致胚胎死亡。

傳統二倍體胚胎幹細胞基因打靶的周期較長，需要把胚胎幹細胞注入到囊胚，發育得到種系嵌合的小鼠，再通過雜交一到兩代來獲得純合動物。而以單倍體胚胎幹細胞為對象進行基因研究和篩選，則會大大縮短實驗周期。我們只需要將攜帶修飾基因的孤雄單倍體胚胎幹細胞注入卵子，便能直接獲得攜帶特定基因遺傳修飾的半克隆小鼠，從而加速出生缺陷、多基因介導複雜疾病的病因分析。這正是我們得以實現快速基因篩選的關鍵所在。

Q：您的團隊還將人造精子技術與基因剪輯技術進行了完美結合，請您談談相關應用。

李勁松博士：人造精子技術與最新基因剪輯技術CRISPR-Cas9結合後，可一步獲得多基因同時敲入/敲除的小鼠模型，還可以培養獲得攜帶多種基因突變的雜合小鼠模型，也能夠通過小鼠個體遺傳篩選從大量候選基因中快速確認重要基因。

另外我們還使用CRISPR-Cas9技術進行了有成效的受精卵基因編輯。我們將攜帶嚮導RNA的CRISPR-Cas9注入雜合子受精卵，發現1/3的新生小鼠白內障症狀被治癒，且被修復的基因還可以遺傳到下一代。同時我們也通過DNA測序發現，治癒小鼠中有2隻存在非靶向基因位點的異常切割。

鑑於1/3的治癒率在疾病臨床統計上仍然較低，以及以上實驗的脫靶風險，我們又發展了精原幹細胞介導的基因編輯研究。至今人類還無法在實驗室條件下，直接複製天然精子和卵細胞。但利用精原幹細胞，則能在體外長期穩定傳代並可減數分裂出具有配子功能的精子。父系先天性白內障的病因之一，是編碼晶狀體蛋白的基因異常；通過體外編輯精原幹細胞基因，我們發現由此培養的精子和由此發育而成的所有小鼠視覺系統都顯示正常。所以精原幹細胞療法對於父系遺傳疾病的治療，是一個方向。

人造精子染色體：安能辨我是雄雌？

Q：人造精子可進行繁殖並傳遞基因修飾的成果列入2012年度中國科學十大進展。從孤雄單倍體胚胎幹細胞到一隻健康小鼠出生，有哪些關鍵的技術裡程碑？

李勁松博士：自然界生物的繁殖方式多樣，某些低等生物可由單倍體配子發育而成；有的昆蟲和低等脊椎動物存在偶發或周期性孤雌無性繁殖；甚至還存在交配後卵母細胞核直接裂解的孤雄生殖。但高等哺乳動物繁衍後代必須由精子、卵細胞的細胞核融合，才能生成完整的受精卵。至今人類尚無法直接在體外複製天然精子和卵子，但上世紀80年代已有科學家構建了哺乳動物胚胎幹細胞系和囊胚。在2011年，又有科學家利用流式細胞分選儀，成功解決了單倍體細胞自發二倍體化的困擾，通過反覆分選和擴增穩定建立了孤雌單倍體細胞系。

我們團隊的成果是在成功培養出孤雄單倍體細胞系之後，將人造精子注入卵子培養為「受精卵」。 人造精子隨著體外培養傳代，會逐漸失去產生半克隆小鼠的能力，其中一個原因就是印記基因的擦除和變化。我們在孤雄單倍體胚胎幹細胞中敲除了H19-DMR和IG-DMR基因，即通過修改調整「人造精子」的相關印記基因表達，最終將半克隆小鼠發育成功率大大提升至20%。目前利用孤雄單倍體細胞培養的動物全部為雌性，原因是攜帶Y染色體的精子不能形成孤雄單倍體胚胎幹細胞，這說明X染色體含有細胞發育不可或缺的重要基因。

Q：在孤雄單倍體胚胎幹細胞研究成果發布之後，您的團隊為何還要研發孤雌單倍體細胞？請您談談具體研究。

李勁松博士：建立精子來源的孤雄單倍體胚胎幹細胞系需藉助複雜的核移植技術，這仍然限制了單倍體細胞技術的應用。為此，我們也希望同步嘗試用卵子代替精子建立單倍體細胞系。其實從上世紀80年代到2011年的重要單倍體胚胎幹細胞研究，建立的都是孤雌單倍體細胞系，但即便實現穩定的細胞系擴增，仍然無法培育出胚胎。我們團隊也曾通過化學物質在體外孤雌激活卵子，由此產生的孤雌單倍體胚胎幹細胞直接注入卵子後可產生胚胎，但移植到小鼠子宮內，同樣無法發育為個體。

所以我們轉變思路，希望將天然卵細胞改造為精子使用。通過對全基因組以及所有印記基因的表達進行高通量測序，我們發現孤雌與孤雄單倍體胚胎幹細胞具有非常相似的表達模式：因為孤雌單倍體胚胎幹細胞的雌性印記基因，在細胞建立和傳代過程中也會快速丟失，逐漸形成類似於孤雄單倍體胚胎幹細胞的基因表達模式。

基於之前對孤雄單倍體胚胎幹細胞的印記基因改造經驗，我們也嘗試對孤雌單倍體細胞進行H19-DMR和IG-DMR基因敲除，同樣成功產生了類似於孤雄單倍體細胞的類精子，並且能達到15.5%的半克隆小鼠出生率，之後這些小鼠均能健康發育到成年並具有生育能力。這證明了哺乳動物孤雌發育的可能性，即胚胎中的兩個基因組拷貝都來自於卵子。目前還有其他學者採取不同方式，將卵子甚至雌性動物體細胞改造為人造精子，讓模式動物構成的「女兒國」在實驗室內存在永續利用的可能。

「女兒國」細胞系的遠大前程

Q：在人類和動物遺傳病、不孕不育治療領域，基因剪輯和細胞重編程技術有哪些應用前景和挑戰？

李勁松博士：這些技術應用於人類胚胎基因編輯和克隆的倫理風險很明確，我個人也持否定意見。但是克隆技術在動物繁殖領域已有很多成熟應用，韓國等國家已廣泛開展家畜和寵物克隆。但是大體型瀕危動物的克隆還存在一些挑戰。學生時代，我參與的課題組曾試圖將大熊貓細胞系和黑熊卵子結合，來克隆我們的國寶大熊貓。我們曾成功培養出克隆胚胎，但移植到黑熊子宮內便發生流產或胎停現象。但如果我們的細胞重編程技術能夠有所突破，瀕危動物克隆對於生態環境的保護和研究會有很大幫助。

人類胚胎基因編輯至今仍不可接受和應用。最新人工輔助生殖技術僅限於從候選胚胎中，利用桑椹胚細胞基因測序，挑選天然基因正常的胚胎並移植進入母體子宮。另外在技術層面，胚胎或精原幹細胞基因剪輯仍存在脫靶效應，我們需優化方法才能100%避免基因組非靶向位點突變。

對於細胞重編程技術在生殖領域的應用，也仍然還僅限於模式動物。克隆和半克隆技術培養的胚胎存活率水平並不高，全克隆囊胚中只有3%能發育為克隆動物，而且需要廣泛採用複雜的四倍體胚胎補償技術。將四倍體胚胎與二倍體胚胎聚合成一個胚胎，在聚合胚胎的發育過程中，四倍體的細胞絕大部分發育成胚外組織，而胎兒則是由二倍體發育而來。這些結果充分證明克隆囊胚的滋養外胚層中存在重編程異常並影響胎兒發育。而通過半克隆技術培養出的小鼠胚胎，我之前已經提到成活率在20%左右，對於實驗室動物研究非常可觀，運用於人類輔助生殖則不能想像。

Q：對於您的團隊和整個研究領域而言，您覺得未來有哪些發展方向？

李勁松博士：不論是天然精子與卵子結合，還是通過細胞重編程實現的克隆/半克隆，配子的表觀遺傳模式都會在受精之後大規模改寫，並結合產生具有細胞全能性的受精卵。全克隆操作過程中，在去核卵細胞的作用下，體細胞核作為終末分化細胞核的分裂次數還會被清零。由此可見生殖細胞的強大分化能力和孕育生命的神奇力量。正因為如此，天然配子的體外獲得仍然是一個難題，希望未來有所突破。另外單倍體胚胎幹細胞在體外培養時，如果不採用流式細胞分選儀則會100%發生自發二倍體化，隱藏在有性生殖背後的調控機制仍是未解之謎，我也非常渴望有人能夠在未來破解這個謎團。

我們課題組最近參加了基因組標記（genome tagging）的大型項目。人類基因組測序計劃完成之後，確認了26000多個編碼蛋白質，至今有42%蛋白質功能研究還是空白，抗體開發是蛋白質組學的瓶頸之一。因為針對不同的蛋白質，抗體種類繁多且親和度不夠穩定，所以我們希望讓所有蛋白質都帶上同樣的DNA序列標籤，這段序列本身也能夠編碼蛋白質。由此利用一種針對標籤DNA序列編碼蛋白的抗體，就可以結合所有26000多種人體基因組編碼蛋白質。這是一個非常龐大的項目，我們希望利用「人造精子」技術，快捷建立分別攜帶這些蛋白質的26000多個小鼠「人造精子」細胞系和標籤小鼠庫，為實現蛋白質功能網絡和生命科學研究的劃時代突破提供強大動力！(生物谷Bioon.com）