日前，中華醫學會病理學分會第二十次學術會議暨第四屆中國病理年會在重慶召開。與會期間，北京大學人民醫院趙昀教授、中國醫學科學院腫瘤醫院郭會芹教授、廣東省人民醫院梅平教授等專家對最新的CINtec PLUS（p16/Ki-67細胞學雙染檢測）以及p16組織學檢測在宮頸癌篩查中的應用進行了交流探討，以有效指導臨床實踐。
p16/Ki-67同時表達提示細胞周期調控失調
持續性的人乳頭瘤病毒（HPV）感染是導致宮頸癌的主要原因。通常，若HPV感染不清除，則會變成永久性，將產生病毒致癌蛋白E6和E7，可分別與腫瘤抑制蛋白p53和視網膜母細胞瘤蛋白pRb結合，使這兩種抑癌基因失活。
p53是重要的腫瘤抑制蛋白，可參與細胞第一個間期（G1）的抑制，促進細胞凋亡和DNA修復。HPV E6蛋白與野生型p53具有高度的親和性，二者結合可使p53快速降解，由此可阻礙細胞對DNA損傷的反應，導致遺傳性狀改變的累積，進而產生基因型惡變。
HPV E7蛋白可幹擾細胞周期，使細胞持續分化和發生癌前病變，導致細胞調控失控，發生永生化，若未經治療，則進展為癌症。E7蛋白可優先與pRb結合，削弱pRb功能，擾亂轉錄因子E2F結合的能力，開始致癌轉化過程，導致上皮細胞的生長失調控，引起包括Ki-67、p16蛋白在內的原本正常的細胞增殖蛋白出現異常表達。
p16基因是細胞周期素依賴性激酶（CDK）抑制劑的典型代表，與多種腫瘤有關，稱為多腫瘤抑制基因，其基因產物對CDK4的活性有抑制作用，因而也稱為p16INK4。 p16過度表達提示正常細胞處於細胞周期的阻滯期，短時間的HPV感染不會影響細胞周期的調控，而持續性HPV感染的細胞的異常增生，導致p16過表達，因此p16過表達可作為宮頸病變的標誌物。而Ki-67是一種標誌著細胞周期進展及增殖期細胞的核抗原基因，其表達僅限於細胞增殖周期的G1、S、G2期和M期，且在G0期表達缺失。Ki-67過度表達提示細胞處於細胞周期的增殖期。通常生理機能正常的細胞，p16和Ki-67的表達會相互拮抗，不會同時出現。如果，p16和Ki-67同時過度表達，則提示pRb蛋白失活，細胞周期調控失調。因此，在同一細胞中同時檢測p16和Ki-67可作為細胞周期失調的標誌物，其與高危型HPV病毒誘導的致癌性轉化相關，能夠幫助檢出真正的病變細胞，且不依賴於形態學檢查結果。當p16/Ki-67檢測陽性時，可強烈提示高級別病變，為區分潛在高級別病變婦女提供了客觀的檢測指標。
2012年7月，美國病理學家協會（CAP）和美國陰道鏡和宮頸病理學會（ASCCP）指南指出，p16可作為反映HPV E6/E7影響細胞增殖的標誌物，有足夠證據表明能夠用於低級別肛門-生殖道鱗狀上皮病變相關推薦，建議使用特定克隆號（E6H4）的 p16INK4a抗體作為檢測 HPV 感染是否影響到細胞周期調控的生物標誌物。該克隆號是全球唯一獲得IVD認證的p16INK4a抗體。
CINtec PLUS（p16/Ki-67細胞學雙染檢測）改善宮頸癌篩查分流管理
目前，我國宮頸癌篩查面臨著細胞學檢測敏感度較低（50-70%）、觀察者間重複性差、質量控制不足、技術人員缺乏等問題，生物標誌物p16/Ki-67的應用可以有效改善細胞學分流檢測。 高靈敏度和特異性的CINtec PLUS檢測可應用於：對無明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASC-US）的分流（特別是針對年輕女性）；低度鱗狀上皮內病變（LSIL）分流；細胞學與HPV聯合篩查時，對細胞學陰性但高危型HPV陽性者進行分流；以及HPV作為初篩時，對高危型HPV陽性者進行分流檢測。CINtec PLUS技術可有效降低高級別宮頸病變的漏診率，為臨床和患者診療提供充分的時間與依據，改善前期宮頸疾病檢測和早期幹預。同時，也可以減少和避免不必要的陰道鏡檢查。
廣東省人民醫院梅平教授在會上分享了CINtec PLUS的臨床研究數據。一項多國家、多中心的前瞻性研究PALMS（Primary ASCUS LSIL Marker Study）對超過27,000名、平均年齡39.9歲的婦女進行篩查。試驗期間對所有婦女進行傳統的細胞學（巴氏塗片）、p16/Ki-67雙染（CINtec PLUS）及HC2 HPV檢測，並以活檢確認CIN2+為檢測終點。研究證實， 相比傳統細胞學，CINtec PLUS檢測在不影響特異性的前提下，對CIN2+的敏感性提高18%（86.7% vs 68.5%）。對於HPV陽性婦女的分流，相比傳統細胞學，CINtec PLUS雙染檢測對CIN3的敏感性提高17%（88% vs71%）。在575例細胞學檢測為ASC-US的患者中，18例患者經活檢證實為CIN2以上， CINtec PLUS雙染的靈敏度為94%，特異性為78%，且高於HC2 HPV檢測。同時，526例LSIL患者中，有63例經活檢證實為CIN2以上，此時CINtec PLUS檢測特異性為54%，遠高於HC2 HPV檢測。
此外，EEMAPS（European Equivocal or Mildly Abnormal Papanicolaou Cytology）回顧性研究對5個歐洲細胞學實驗室總計776例ASC-US/LSIL液基細胞學（ThinPrep）剩餘標本，進行了細胞學採樣後6個月內活檢、p16/Ki-67雙染（CINtec Plus）及HC2 HPV檢測。其中，在361例ASC-US患者中，有77例證實為CIN2以上；在425例LSIL患者中，有72例證實為CIN3以上，CINtec PLUS檢測針對CIN3+以上檢測的靈敏度達到96%，而特異性為68%，高出HC2 HPV檢測49%，說明雙染檢測可作為更合理的LSIL分流手段。
當採用細胞學與HPV聯合篩查時，CINtec PLUS雙染檢測可應用於對細胞學陰性但高危型HPV陽性者進行分流檢測。一項入組425例30歲以上、細胞學陰性、高危HPV檢測陽性婦女的試驗結果顯示，CINtec PLUS雙染檢測針對CIN2+的靈敏度達到91.9%，而特異性為82.1%，針對CIN3+的靈敏度達到96.4%，而特異性為76.9%。
會上醫科院腫瘤醫院的郭會芹教授還分享了CINtec PLUS的閱片體驗，雙染閱片可以有效的減輕閱片醫生的負擔。另外，對於形態學診斷有疑難的病例，如一些擁擠的細胞團到底是HSIL 還是反應性改變，雙染檢測可以起到輔助診斷的作用。羅氏診斷CINtec PLUS Cytology檢測可實現對p16與Ki-67的聯合檢測，具有優秀的特異性和靈敏度，p16信號（棕色）與 Ki-67信號（紅色）在同一個細胞內，以同時出現胞漿的棕染和胞核的紅染可判斷為陽性結果。該檢測預計將於2015年年底在中國上市。
p16組織學檢測：提高病理診斷的準確性，指導宮頸癌臨床診療
北大人民醫院的趙昀教授，從臨床醫生的角度，探討了p16在臨床中的使用意義。趙教授在會上特別強調了宮頸病變的過度治療，給患者帶來的損傷，因此臨床需要準確的病理診斷結果以指導患者的治療。
通常，宮頸鱗狀上皮癌前病變即宮頸上皮內瘤樣病變（CIN）按病變程度分為CIN1、CIN2和CIN3，臨床根據不同的病變程度治療策略也不盡同。對CIN進行更準確的分級，對於臨床治療決策至關重要。雖然H&E（Hematoxylin-eosin staining，蘇木精-伊紅染色法）染色組織形態學的判讀是目前對CIN進行分級的標準，但它容易受到病理醫生主觀判斷的影響，尤其是CIN2的可重複性最差。隨著基礎和臨床研究的不斷深入，HPV和宮頸癌之間的關係日益明確，逐漸認識到，HPV以游離狀態存在於宮頸細胞中，通常引起宮頸低級別病變（LSIL），其進一步進展為宮頸癌的風險極低，不是真正的癌前病變；以整合形式存在於宿主細胞時，則引起宮頸高級別病變（HSIL），這才是真正的癌前病變，進展為宮頸癌的風險高。基於此，美國病理學會（CAP）和美國陰道鏡和病理協會（ASCCP）聯合發表共識(LAST項目)，建議將宮頸鱗狀上皮內病變採用兩級命名法，分為低級別和高級別病變。前者包括三級命名法的CIN1，後者包括CIN2、CIN3。2014年出版的第四版女性生殖器官腫瘤WHO分類也推薦採用該命名法。但在實際工作中，CIN2的H&E診斷結果一致性較低，即便是在病理醫生嚴格受訓的美國，醫生對同一病例的診斷也存在較大分歧。實際上，CIN2中部分是真正的高級別病變，還有相當一部分是低級別病變。當形態學鑑別高級別或低級別病變存在爭議時，推薦採用生物標誌物輔助鑑別診斷。
LAST項目證實，p16INK4a的應用對提高診斷一致性具有高質量證據，推薦在以下四種情況使用p16INK4a 染色：HSIL和類似非腫瘤性病變需要鑑別診斷時，如不成熟鱗化、萎縮、修復性上皮增生及人工操作所致假象；有疑問的CIN2；不同閱片人診斷意見不同；HPV檢測、細胞學、陰道鏡提示有高級別病變可能，但組織學診斷為陰性。基於LAST項目數據，2014年WHO也推薦對於有疑問的診斷，可以採用p16INK4a免疫組化染色，提高宮頸病變組織學診斷的準確性和病理醫師之間診斷的一致性。
基於病理學診斷的更新，宮頸病變臨床管理隨之調整。CAP和ASCCP推薦LSIL管理同CIN1的管理；HSIL，對於大多數女性而言，管理同CIN2/3。對於CIN2/p16INK4a陰性的病例按照低級別病變（LSIL）管理，隨診觀察；對於CIN2/p16INK4a陽性的病例按高級別病變（HSIL）管理，推薦治療。根據SEER研究統計，25歲以下女性宮頸癌發病率僅為1.5/100,000。因此，對於年輕女性的HSIL（CIN2）或HSIL但未明確CIN2或3的病例，可以每6個月進行一次細胞學和陰道鏡檢查，若病變持續24個月、陰道鏡檢查不滿意、病變面積增大或陰道鏡檢查較之前加重，則給予治療。
通過生物標誌物p16INK4a能夠從更微觀的層面理解宮頸癌前病變的病理機制，提高LSIL/HSIL判讀的準確性，確保臨床對患者進行更合理的分流管理。羅氏診斷CINtec組織學p16檢測（包含抗p16INK4a抗體（E6H4））已於2014年5月在中國上市。
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