造血幹細胞（Hematopoietic stem cell, HSC）位於成體造血系統的最上遊，具有自我更新能力並可產生所有類型的血液細胞。目前研究認為，HSC起源於胚胎發育中期的生血內皮細胞，主要定位在主動脈-性腺-中腎（aorta-gonad-mesonephros, AGM）區的背主動脈腹側【1】。由於數量稀少、發育時間轉瞬即逝、體內功能評價系統的技術門檻較高，研究者一直未能精準捕獲及分離具有HSC重建潛能的（HSC-competent）生血內皮細胞，其從原始內皮細胞逐步特化並走向HSC命運這條路徑的細胞轉歸及分子事件仍不清晰，甚至存在爭議【2,3】。
近年來研究者利用已知的生血內皮細胞轉基因報告小鼠，包括Runx1 +23GFP和Gfi1-Tomato，報導了應用單細胞基因表達分析來解析內皮-造血轉化事件的研究【4,5】。然而這些報告基因對於生血內皮細胞的富集效率或者特異性仍然不足。而且，這些基於選定群體的測序可能會帶來研究結論的偏頗性，例如研究者認為生血內皮細胞和非生血的內皮細胞在轉錄組水平具有非常相似的分子特徵【5】。因此，有必要對胚胎血管內皮細胞進行無偏篩選來精準識別具有HSC命運的（HSC-primed）生血內皮細胞。
劉兵/蘭雨合作團隊近期發表在Cell Research的研究利用單細胞轉錄組測序技術，從單細胞尺度解析了人類胚胎造血幹祖細胞發生的細胞層級以及分子特徵，並篩選獲得富集生血內皮細胞的表面標誌【6】。相較於人類胚胎的研究，小鼠作為重要的實驗模型，具有樣品來源的可控性、體內功能評價及遺傳操作的可行性等諸多優勢，從而使得基於重要群體捕獲分離的精細體內外功能評價成為可能，這對於HSC-primed生血內皮細胞來講尤為重要。
2020年3月20日，暨南大學基礎醫學院蘭雨研究組、北京大學生命科學學院湯富酬研究組和解放軍總醫院第五醫學中心劉兵研究組合作在Cell Research雜誌在線發表了題為「Embryonic endothelial evolution towards first hematopoietic stem cells revealed by single-cell transcriptomic and functional analyses」的研究論文。該研究首先利用高精度的單細胞轉錄組測序無偏篩選了HSC發生時空的所有血管內皮細胞，鑑定出兩群轉錄組特徵不同的動脈內皮細胞並精確識別了HSC-primed生血內皮細胞；通過計算篩選得到候選表面標誌組合PK44並構建了全新的基因敲入螢光報告小鼠Neurl3-EGFP，實現了HSC-competent生血內皮細胞的高效分離；進一步在單細胞轉錄組水平解析了從原始內皮細胞特化為HSC-primed生血內皮細胞全過程多步驟的細胞轉歸及分子事件。
作者首先對胚胎期（embryonic day, E）9.5到11.0天連續發育階段胚內的血管內皮細胞進行流式分離，並通過顯微操作主動脈灌注螢光染料富集了AGM區主動脈的血管內皮細胞。通過高精度的單細胞轉錄組測序鑑定出HSC-primed生血內皮細胞和兩個時空分布相近而分子特徵不同的動脈內皮細胞群體。相較於動脈內皮細胞，生血內皮細胞具有更為活躍的細胞周期和翻譯活性、保留相當的動脈特徵而缺乏靜脈特徵，這與該團隊在人類胚胎中的發現一致【6】。進一步的擬時序分析發現動脈內皮細胞在HSC發生的時空具有自我成熟以及生血特化兩個方向的命運。
接下來，作者通過計算篩選，結合與該團隊之前鑑定功能性pre-HSC類似的體外孵育後移植系統【7】，證實在E10.0 AGM區的HSC-competent生血內皮細胞富集在CD41-CD43-CD45-CD31+CD201+Kit+CD44+（PK44）的免疫表型中。對PK44細胞的測序證實該群體很好地代表了HSC-primed生血內皮細胞群體。體外的單細胞培養發現近半數的PK44細胞具有生血潛能，其中少量細胞穩定地具有內皮和造血雙向分化潛能。有趣的是，T1 pre-HSC雖然較HSC-primed生血內皮細胞在轉錄組水平更具造血特徵，其體外的內皮分化潛能大大下降，但仍保留類似的內皮和造血雙向分化潛能。
進一步，作者鑑定出11個HSC-primed生血內皮細胞的特徵基因，並選取其中表達最充分的Neurl3構建了Neurl3-EGFP基因敲入螢光報告小鼠。功能學分析證實內皮細胞中Neurl3-EGFP的表達富集了HSC-competence。重要的是，該報告小鼠提供了HSC-competent生血內皮細胞的精確解剖學定位信息（圖1）。通過流式比對以及index sorting策略，發現PK44是Neurl3-EGFP陽性的內皮群體中體內重建功能以及體外生血潛能和內皮造血雙向分化潛能均更加富集的亞群（圖2）。
圖1. Neurl3-EGFP特異性表達在主動脈的生血內皮細胞
圖2. PK44與Neurl3-EGFP的表達及功能相關性
為了追溯HSC-primed生血內皮細胞從原始內皮細胞起始的特化路徑，作者將E8.0-9.0的早期血管內皮進行單細胞轉錄組測序並一同納入研究，鑑定出新增加的早期動脈內皮和原始內皮群體。基於發育時序分析，以及細胞真實的取材時間點，可以推斷出原始內皮向HSC-primed生血內皮細胞的特化過程經歷了兩次命運的選擇，即首先選擇動脈命運形成原始動脈內皮，之後再選擇造血命運最終走向HSC。作者進一步解析了該特化過程中的一系列差異基因、潛在功能性轉錄因子、生物學過程和信號通路，揭示了該過程中波動性的基因表達模式（圖3）。
圖3. 原始內皮特化為HSC-primed生血內皮的細胞及分子演進
綜上所述，本研究從轉錄組（transcriptome）、免疫表型（immunophenotype）和功能（function）三個層面（tif）重新規範定義了生血內皮細胞，實現了較以往研究提高近20倍富集效率的生血內皮細胞捕獲和分離【4】，並首次在單細胞水平證實生血內皮細胞具有內皮和造血雙向分化潛能，成功構建了更加敏感和特異性標識HSC-primed生血內皮細胞的螢光報告小鼠，揭示了從原始內皮細胞到HSC-primed生血內皮細胞的兩步特化路徑。這些發現對HSC體內發育及體外再生研究提供了重要的理論基礎、資料庫資源和小鼠模型。
蘭雨研究員、湯富酬研究員和劉兵研究員為該論文的通訊作者。侯思元博士、李宗城博士、鄭曉娜博士、博士研究生高雲、博士研究生董驥和倪豔麗碩士為該研究論文的第一作者。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41422-020-0300-2
參考文獻
1. Dzierzak, E. & Bigas, A. Blood Development: Hematopoietic Stem Cell Dependence and Independence.Cell Stem Cell 22, 639-651, doi:10.1016/j.stem.2018.04.015 (2018).
2. Ditadi, A., Sturgeon, C. M. & Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish.Nat Rev Mol Cell Biol18, 56-67, doi:10.1038/nrm.2016.127 (2017).
3. Ditadi, A. et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.Nat Cell Biol 17, 580-591, doi:10.1038/ncb3161 (2015).
4. Swiers, G. et al. Early dynamic fate changes in haemogenic endothelium characterized at the single-cell level.Nat Commun4, 2924, doi:10.1038/ncomms3924 (2013).
5. Baron, C. S. et al. Single-cell transcriptomics reveal the dynamic of haematopoietic stem cell production in the aorta.Nat Commun9, 2517, doi:10.1038/s41467-018-04893-3 (2018).
6. Zeng, Y. et al. Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.Cell Res 29, 881-894, doi:10.1038/s41422-019-0228-6 (2019).
7. Zhou, F. et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution.Nature533, 487-492, doi:10.1038/nature17997 (2016).