作者：桂林醫學院附屬醫院骨科 武成聰
前言
近年來幹細胞的研究為骨組織工程提供了新的思路。多種途徑可誘導骨髓間充質幹細胞骨(BMSCs)向成骨細胞分化，最主要的細胞因子是骨形態發生蛋白（BMP）。其通過何種途徑激活幹細胞向成骨細胞分化及其採用何種途徑能使BMP誘導BMSCs骨化為臨床治療骨缺損提供更好的服務。本文應用計算機檢索近10年來國內外應用BMP誘導BMSs的相關文獻，並對其研究現狀進行總結性歸納。
研究現狀
BMSCs的成骨分化
BMSCs在特定的條件下向成骨、成軟骨、成脂肪和成肌細胞分化，體外擴增20-50代後仍保持其多向分化潛能。現已經成為組織工程化骨（TEB)的主要種子細胞源。種子細胞（群）的生長分化很大程度上取決於細胞自身特點及細胞生長所處的微環境。接種種子細胞的濃度一定程度上影響到細胞的分化和增殖能力。KimK等認為改變種子細胞之間的距離可以改變細胞旁分泌的信號傳導。
目前已經證實BMSCs處於特定化學物質（β-磷酸甘油、地塞米松、維生素C）、細胞因子（BMP、bFGF等）、機械力學刺激等體外環境培養過程中具有明顯的成骨細胞分化能力。不過單純的BMSCs中部分細胞在沒有成骨誘導因素的條件下也可向成骨細胞分化，普通兔BMSCs複合脫鈣骨能夠成功誘導兔膝關節軟骨缺損修復。相對於單純的BMSCs，其向成骨分化的能力與其所處的生長環境密切相關。IshikawaH等體外培養BMSCs過程中給予rhBMP2幹預，細胞增殖能力增強，同時在傳代過程中仍保持成骨分化能力。
近年來發現，包括傳統的細胞因子及相關物理化學刺激因素在內成骨生長肽（OGP）能通過RhoA/ROCK途徑促進BM-SCs向成骨細胞分化，且存在劑量依賴性。硼（boron）在人BMSCs增殖分化過程中促進成骨相關基因合成。OnoM等認為Wnt信號誘導的分泌蛋白1（WISP-1/CCN4）促進小鼠BMSCs分化，其可能機制是通過WISP-1加強BMP-2的作用並綁定整合素α(5)β(1)促進成骨分化。
BMP-2相關肽P24蛋白、正常血糖水平、辛伐他汀同樣具有促進BMSCs成骨分化和其增殖能力。KaiglerD等通過體外實驗研究發現內皮細胞（Endothelialcell）在直接與小鼠BMSCs直接接觸培養過程中顯著增加BMSCs的成骨分化能力。在各種成骨誘導因素中研究較多的主要是BMP，眾多學者已經開始運用BMP製作異常骨化疾病模型及陽性對照標準。任遠等將BMP4基因包裝入慢病毒載體轉染鼠BMSCs並注射入裸大鼠大腿股四頭肌鍵，成功建立了BMP4基因誘導異位骨化模型。
BMP與BMSCs的成骨分化
BMP能促進未分化的間充質細胞及骨系細胞募集、分化並啟動骨生成，並在後期骨組織的形成、生長和損傷的修復發揮著關鍵作用。同時也在多種細胞的增殖、分化、組織再生、改建中發揮各種調節作用。
BMP促進BMSCs向成骨分化的機制尚目前不明確，細胞內信號傳導機制可能是通過Ⅰ、Ⅱ型BMP受體（絲氨酸/蘇氨酸激酶受體）轉導，其中I型BMP受體(BMPRIa)直接參與調控骨生成及骨密度。BMP與BMPRIa和II型受體結合後激活Smad信號通路。BMP激活BMP-RI激酶後使其轉錄調節因子Smad被磷酸化，磷酸化的Smad1、Smad5和Smad8再與Smad4形成複合體並轉移到細胞核後誘導BMP下遊靶位基因表達。
信號傳導過程中Smad6和Smad7可抑制R-Smad的磷酸化，同阻止R-Smad磷酸化後與Smad4形成複合體。沈奕等在研究BMSCs相關信號因子中發現：骨形態發生蛋白2在種子細胞成骨過程中與骨形態發生蛋白1a存在相關性，但與骨形態發生蛋白1b無關聯；成骨相關信號因子（SOST）與鹼性磷酸酶、MSX2及骨形態發生蛋自受體1a有相關性。
這些信號通路直接關係到組織工程骨成骨過程，而且能被相關因子激活。Lin等發現在BMP-2刺激下miR-199a通過作用於轉錄因子Smad1反向調節早起軟骨細胞的分化。Li等發現mi-croRNA-miR-2861對BMP-2誘導的成骨分化具有促進作用。Li等發現miR-133和miR-135分別通過作用於3'端非編碼區調控RunX2及Smad5,從而調控BMSCs向成骨方向分化。
BMP誘導BMSCs骨化的途徑
在眾多具有激活或抑制細胞成骨相關信號通路的因子中，BMP表達是目前研究調控BMSCs向成骨細胞分化主要誘導因子，其途徑主要包括通過直接或間接增加BMP含量促進BMSCs向成骨細胞分化。
天然型BMP誘導BMSCs骨化
目前主流方法是將BMP通過生物材料直接釋放至需骨或軟骨組織再生的部位。如果需要長時間誘導BMSCs骨而進行大面積骨重建時，研究者多傾向於選擇控制釋放性載體或支架。Simmons,CA等以海藻酸鈉水凝膠為生物支架將BMP2和轉化生長因子-β3(TGF-β3)以單獨形式和共同組合形式誘導SCID小鼠BMSCs成骨過程中發現BMP2誘導種子細胞成骨過程中的有效蛋白濃度與生物支架材料形態有關，適當可溶性生物材料複合細胞因子後可能通過調控種子細胞骨再生信號從而能使更低濃度的細胞因子誘導組織再生更高效。
天然BMP誘導BMSCs骨化呈劑量依賴性，不同劑量BMP誘導種子細胞的能力不同。RoostaeianJ等直接運用人骨形態發生蛋白2誘導兔BMSCs成骨，發現其最佳適合濃度為50ng/mL。在天然BMP誘導分化的同時，輔助其他誘導因素往往具有協同作用。WangL等發現：單純的BMP2作用於小鼠BMSCs僅較低程度上增加幹細胞ALP和礦化水平，但BMP2聯合成骨培養基時明顯增強了BMSCs的成骨分化能力。
BMP誘導BMSCs骨化的其他途徑
天然BMP的彌散作用和半衰期決定了直接將BMP植入體內其使用劑量大，成本較高導致臨床成骨效果不佳。研究者致力於採用通過載體緩釋技術使BMSCs獲得長時間足量的BMP刺激，但是仍需克服在支架材料中整合的BMP不受生物活性因子影響的難題。通過基因治療或者改善細胞所處微環境促進BMP表達成為了當前研究的熱點，利用轉基因技術將外源性基因導入種子細胞內並使之持續、穩定、高效表達BMP，從而彌補天然BMP客觀缺陷，並穩定表達的細胞因子提供良好的微環境利於BMSCs骨化。
ZhuL等以腺病毒為載體將BMP7基因導入山羊BMSCs治療山羊節段性骨缺損，BMP7能夠明顯促進骨缺損新生骨生成並且在術後5月新生骨生物力學滿足生理要求優於對照組的8個月。不過在應用腺病毒作為BMP基因轉染載體時仍然存在一些問題，XuXL等以腺病毒為載體介導人BMP2基因轉染山羊BMSCs修復骨缺損，首次驗證轉染BMP基因適用於大型動物負重骨骨缺損，24周後轉染組新生骨的最大壓縮強度優於對照組，但作為基因運載體腺病毒也同時引起宿主短暫的細胞和持續性的體液免疫抵抗反應，這點也是腺病毒作為載體的缺陷，限制了其大規模的臨床發展。
如何能夠將目的基因導入BMSCs並且引起最小的宿主免疫反應，研究者目前選用質粒、腺相關病毒、杆狀病毒(BV)、非病毒PEI衍生物(GenEscortTMII)以及慢病毒等作為目的基因轉載工具均能使BMSCs過表達BMP基因和蛋白從而刺激成骨相關信號通路誘導靶細胞向成骨細胞分化，轉染後細胞目的BMP、鹼性磷酸酶(ALP)和骨鈣素表達量顯著提高，骨缺損區域最終形成新生骨組織。
除外直接轉導已編碼的BMP基因序列進入BMSCs這種途徑，研究者發現納米材料上粘附菸草花葉病毒(TMV)可直接通過促進內源性BMP2基因合成增加而使得體外培養的BMSCs在24h後向成骨細胞分化並且形成鈣化結節。纖維母細胞生長因子（FGF18)能夠促進BMSCs上調BMP4mRNA表達水平。同天然BMP一樣，各種細胞因子之間也具有明顯的協同作用。BMP2和Nell-1基因能協同促進兔兔上頜竇新骨的形成。單獨的BMP2蛋白可能使BMSCsDNA結合抑制因子（Id1）過度表達促進骨生成,而聯合VEGF則能使Id1表達達到最佳狀態減少過度骨生成及過度的終末成骨細胞化。
BMP2-BMP9基因、BMP2-hVEGF165基因，BMP4-BMP7等在成骨過程中均具有很好的協同作用，從而使BMP促進BMSCs骨化表達達到一個最佳平衡狀態。在作用時間方面間接轉基因技術也表現出了該途徑的優勢，Lin等通過BV介導的BMP2/VEGF基因轉染BMSCs，基因表達時間可超過28天。能夠為BMSCs提供足夠量的細胞因子誘導其向成骨細胞分化。
小結與展望
近年來，研究者們無論運用天然BMP或者通過相關載體介導BMP基因轉導BMSCs而誘導其向成骨分化都取得了進步，尤其是在發現相關其他協同治療細胞因子、基因或其他物質上取得了進一步科研成果，為更完善的治療骨缺損提供了較多的實驗依據。
但無論通過生物材料運載天然BMP或者載體介導BMP基因轉染BMSCs植入缺損區域必然會帶來一序列宿主免疫反應。目前並未發現完全不產生免疫反應的載體，故在誘導骨化時也應該充分考慮載體選擇問題。再有，各種BMP基因和相關協助基因轉染進入宿主體內，其造成局部BMP或者其他因子蓄積過高，存在基因組序列突變等致癌風險。
BMP誘導成骨的信號傳導通路是否存在多條途徑尚未清楚，以及是否能夠通過直接激活相關通路上的某些信號分子激活並調控成骨或者能否從轉錄因子調控水平尋找誘導成骨基因治療可能是未來的研究方向，如最近microRNA的研究可能是一個新的途徑。
綜上所述，BMP在誘導BMSCs成骨分化的作用顯著，仍存在著許多未知問題，但其在治療骨缺損方面仍然具有光明的前景。
來源：現代生物醫學進展2014年第21卷第14期
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