近年來國內外關於幹細胞的研究取得了重大的突破，而這其中最熱門的研究當屬間充質幹細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）。MSC是一類具有自我更新和多種分化潛能的成體幹細胞，來源於胚胎發育早期的中胚層未成熟的胚胎結締組織。1968年德國科學家Frieden Stein在骨髓中首次發現了間充質幹細胞（MSC），後來研究者陸續在全身多種組織如脂肪、臍帶、牙髓中分離出了MSC。MSC屬於多能幹細胞，具有多向分化潛能，1999年，《科學》雜誌首次報導了Pittenger等科學家在體外成功誘導了骨髓MSC分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞，此後，科學家又陸續成功誘導MSC分化成為肌肉、韌帶、肝、心肌和內皮等多種其它細胞（如下圖）。
目前，MSC的鑑定主要通過形態學觀察（如呈纖維細胞樣生長，細胞中央有卵圓形核，密度較高時呈渦旋狀或放射狀生長）、表面標誌物檢測（如CD29、CD44等）以及多系分化潛能鑑定。這裡的多系分化潛能通常指成骨、成脂和成軟骨分化，稱為MSC的三系分化。雖然目前MSC三系分化的誘導過程和鑑定方法都已經相對成熟，但三系分化的原理可能還未被大家所熟知。為了更好地理解MSC的三系分化，本文初步總結了MSC三系分化的大概過程，分化過程中出現的一些標誌物以及對應的檢測方法。
1 骨髓間質幹細胞成骨誘導分化
間質幹細胞向成骨細胞的分化是理解骨形成機制的有力工具，它也被用於鑑別骨質疏鬆症、骨修復和成骨不全等遺傳紊亂疾病。
同其他組織器官一樣，骨組織也在不斷地進行著細胞代謝，稱為骨代謝。它可以大致分為骨形成和骨重塑兩個階段，前者在個體生長發育期起主要作用，後者則持續整個生命周期。成骨分化是骨生成的關鍵步驟，即骨髓間充質幹細胞經歷骨原細胞（osteoprogenitor cells）、成骨前體細胞（pre-osteoblasts）、成熟的骨細胞（osteoblasts）和終末階段的骨細胞（osteocytes）的一個複雜的過程，其中涉及到多種類型細胞間和細胞內的信號傳遞，如信號通路、轉錄因子、生長因子、MicroRNA 等，形成了一個完整的骨代謝調控負反饋環路。不同階段的細胞群之間無明顯的界限，它們是一個連續發生發展的過程。具體過程如下：
1）多種刺激因子和激素的刺激及其他特定的理化因素作用下，間充質幹細胞定向分化為骨原細胞；
2）其後，骨原細胞進一步分化為成骨細胞前體細胞，進入快速增殖期;
3）細胞增殖能力逐漸下降，細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）成熟相關基因（鹼性磷酸酶、I型膠原、基質鈣蛋白）被進一步激活，成骨細胞在此階段合成和分泌有機基質，形成類骨質，主要由I型膠原形成，特徵物是鹼性磷酸酶，是成骨細胞分化成熟的早期標誌；
4）成熟的成骨細胞表達ECM鈣化相關蛋白，主要是骨鈣蛋白和骨橋蛋白，成骨細胞礦化活力顯著升高。
與成骨分化的體內過程相對應的，體外誘導成骨分化的鑑定主要是通過檢測成骨細胞的生物學標誌以及相關的標誌基因來進行的。短期的成骨分化可通過鹼性磷酸酶來檢測，長期的成骨分化則通過檢測茜紅素染色骨結節來鑑定。具體檢測以下三種物質：
1）鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）：鹼性磷酸酶經固藍染色後在顯微鏡下呈現藍色，未分化的細胞則無明顯顏色。可通過統計各樣品中細胞鹼性磷酸酶的平均表達強度對其成骨能力進行評估對比。可通過統計各樣品中成骨分化細胞的百分比加以對比或統計ALP染色照片的平均灰度（固定各項拍攝參數）進行對比，還可通過溶解藍色物質後測吸光度。
2）「鈣結節」：長時間的成骨誘導會使鈣離子以鈣鹽方式沉澱下來，形成「骨結節」。骨結節可通過茜素紅染色（茜素紅和鈣發生顯色反應，產生一種深紅色化合物），把外面沉積的鈣結節染成深紅色，通過著色物面積和深淺來表示成骨分化的強弱。
3）MSC成骨分化後明顯的成骨細胞特徵性基因，如ALP，Runx（runt related gene II）等。可使用RT-PCR對比不同實驗組別的成骨分化差異。
下圖是骨髓間充質幹細胞的成骨分化誘導圖，圖中深紅色部分為鈣結節。
2 骨髓間質幹細胞成脂誘導分化
脂肪組織由脂肪細胞組成，對保持能量和代謝平衡非常重要。脂肪組織有兩種，一種為白色脂肪組織（WAT），主要分布在皮下和內臟，內臟白色脂肪與肥胖、病理驗證和胰島素抵抗相關，皮下白色脂肪則可提高葡萄糖耐受性；另一種為棕色脂肪組織（BAT），主要呈離散狀分布在脊椎旁、鎖骨和腎上腺，功能是產熱。這兩種脂肪組織有相同的分化特徵，都是由間充質幹細胞分化而來。
間充質幹細胞成脂分化有兩個階段，先是MSC分化為脂肪前體細胞，接著在特定的細胞刺激影響下（如C/EBPs和PPAR-γ）最終分化為脂肪細胞，出現脂肪細胞中顯著的標誌物（脂肪滴），如下圖：
體外誘導成脂分化的鑑定
1.檢測成脂誘導後細胞的胞漿中的油滴（脂肪滴）。脂肪滴經油紅O染色後在顯微鏡下呈現顯著的紅色，未分化細胞則無明顯顏色。通過統計各樣品中成脂分化細胞的百分比來對成脂分化強弱加以表徵對比。
2.MSC成脂分化後有明顯的成脂特徵性基因表達，如LPL、PPARγ等。可使用RT-PCR通過對相關基因表達量的測量，對比不同實驗組別的成脂分化差異。
下圖是骨髓間充質幹細胞的成脂分化誘導圖，可以看到圖中有明顯的脂肪滴。
3 骨髓間質幹細胞成軟骨誘導分化
軟骨的破壞、缺失是包括骨關節炎（osteoarthritis，OA）在內的多種骨科疾病的重要病理改變。由於軟骨特殊的解剖及組織特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修復能力異常不足，因此通過人工方法修復軟骨破壞具有重要臨床意義。近年來，隨著間充質幹細胞的發現和研究深入，其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能、與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在軟骨修復應用中具有令人期待的潛力。
MSC成軟骨分化的過程：MSC首先收回其突起，聚集成團，這個團中間的細胞經分裂分化轉變成一種大而圓的細胞，即成軟骨細胞；成軟骨細胞產生基質和纖維（主要為II型膠原蛋白），當基質的量增加到一定程度時，成軟骨細胞被分隔在陷窩內，分化為成熟的軟骨細胞。
體外誘導成軟骨分化的鑑定主要圍繞成軟骨的標誌物——II型膠原蛋白來進行，包括通過免疫組化、Westernblot檢測II型膠原蛋白的表達和RT-PCR檢測II型膠原蛋白的mRNA的表達，不同的角度進行鑑定；而甲苯胺藍則主要檢測成軟骨細胞內酸性粘多糖。
下圖是骨髓間充質幹細胞的成軟骨分化誘導圖，可以看到軟骨細胞埋藏在軟骨間質內，它所存在的部位為一小腔，稱為軟骨陷窩（cartilage lacuna）。
自我更新能力和多向分化能力是幹細胞的兩個最基本特徵。幹細胞誘導分化是幹細胞鑑定的主要方法，也是幹細胞功能學研究的主要途徑。
參考文獻
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虞翼哲董學海，陳海丹，趙紅衛《間充質幹細胞應用於軟骨組織工程的研究進展》
Cristancho AG, Lazar MA. Forming functional fat: a growing understanding of adipocyte differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12(11):722-734. Published 2011 Sep 28. doi:10.1038/nrm3198