前列腺癌為男性最普遍的癌症之一，隨著年齡增加更為嚴重。在亞洲地區，近年來男性罹患前列腺癌的發生率及死亡率逐年增高。牛樟為臺灣特有真菌，許多研究指出其具有抗癌效果。根據研究顯示牛樟芝子實體萃取物可抑制腫瘤停止生長及凋亡 ， 但有關對於前列線癌細胞之影響的機制探討尚不明確 。 本研究使用牛樟芝子實體乙醇粗萃取物 ( ACCE ) 及牛樟芝管柱層析分離物 ( CFK4、CFK6 ) 進行實驗探討牛樟子實體萃取物對前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 的抑制效果，觀察是否能誘導前列腺癌細胞進行細胞凋亡。MTT assay 實驗中 ， 以 ACCE 、CFK4 、CFK6 處理前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 經過 24 小時之後，細胞存活率會隨著萃取物的濃度增加而下降，前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 均對 CFK6 較為敏感 ， 計算 CFK6 抑制前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 50% ( 50% inhibition concentration, IC50 ) 抑制濃度分別為 10.57 μg/ml 和 5.42 μg/ml。觀察細胞型態結果，隨著 CFK6 處理時間增加，前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 細胞型態不完整 、 細胞膜明顯皺縮 、 細胞膜上有 Phosphatidylserine ( PS ) 外翻情形。使用 PI 染色，發現前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 分別經由藥物處理過後 SubG1 比例增加，其次使用 DNA 電泳分析，對於前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3 分別經由藥物處理過後，DNA 斷裂呈階梯狀片段，由以上兩種實驗顯示，牛樟芝子實體分離物 ( CFK6 ) 會促使前列腺癌細胞走向 apoptosis。最後在 Pan-caspase 活性測試及西方點墨法結果顯示，經不同濃度 CFK6 處理後前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3，會活化 caspase-3、caspase-8、caspase-9、Fas-L 和 Bax 的蛋白表現量增加，而 Bcl-2 蛋白表現量減少，caspase-7 蛋白沒有明顯表現；在 p53 蛋白方面，前列腺癌細胞 LNCaP 隨著 CFK6 處理濃度增加，p53 蛋白明顯表現；前列腺癌細胞 PC-3 隨著 CFK6 處理濃度增加，p53 蛋白表現量較不明顯。由以上實驗結果證實，CFK6 對前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3，主要凋亡路徑透過外部訊息傳遞路徑 Fas-L 蛋白表現，活化下遊 caspase-8，活化的 caspase-8 會走向粒腺體傳遞路徑 Bax/Bcl-2，改變粒腺體膜電位釋放 cytochrome-c，來活化 caspase-9、caspase-3，而導致細胞凋亡。
研究目的
本論文主要利用實驗室分離純化之 CFK6 ， 處理人類前列腺癌細胞株 LNCaP ( androgen-sensitive human prostate adenocarcinoma cells )、PC-3 ( independent-sensitive human prostate adenocarcinoma cells )，作為研究平臺，探討 CFK6 對人類前列腺癌細胞株之抑制生長作用及機轉。
實驗結果
CFK4 及CFK6 對前列腺癌細胞株 ( LNCaP ) 存活率影響之比較圖。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
牛樟芝子實體乙醇萃取物 ( ACCE ) 對前列腺癌細胞株( PC-3 ) 存活率之影響。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK4 及CFK6 對前列腺癌細胞株 ( PC-3 ) 存活率影響之比較圖。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
10 μg/ml CFK6處理後不同時間內 LNCaP 細胞形態。 LNCaP 經由 10 μg/ml CFK6 處理 24、48hr 後，細胞數目減少且細胞膜皺縮
5 μg/ml CFK6 處理後不同時間內 PC-3 細胞形態。 PC-3 經由 5 μg/ml CFK6 處理 24、48hr 後，細胞數目減少且細胞膜皺縮，有細胞懸浮情形 ( 紅色箭頭所指 )
10 μg/ml CFK6 處理後不同時間內 LNCaP 細胞形態。
※ Annexin V-FITC : 細胞凋亡早期，呈現綠螢光
PI : 細胞壞死，呈現紅螢光
Annexin V-FITC/PI : 細胞凋亡晚期，紅螢光與綠螢光重迭
5 μg/ml CFK6 處理後不同時間內 PC-3 細胞形態。
※ Annexin V-FITC : 細胞凋亡早期，呈現綠螢光
PI : 細胞壞死，呈現紅螢光
Annexin V-FITC/PI : 細胞凋亡晚期，紅螢光與綠螢光重
10 μg/ml CFK6處理後不同時間內 LNCaP 細胞周期。
CFK6 處理 24hr 之後不同濃度內 LNCaP 細胞周期。
10 μg/ml CFK6處理後不同時間內 LNCaP 細胞 Sub-G1 phase 定量分析。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK6 處理 24hr 不同濃度內 LNCaP 細胞 Sub-G1 phase 定量分析。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
5 μg/ml CFK6處理後不同時間內 PC-3 細胞周期。
CFK6 處理 24hr 不同濃度內 PC-3 細胞周期。
5 μg/ml CFK6處理後不同時間內 PC-3 細胞 Sub-G1 phase 定量分析。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK6 處理 24hr 不同濃度內 PC-3 細胞 Sub-G1 phase 定量分析。(n=3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.00
CFK6 誘導兩株前列腺癌細胞株 DNA 片段化影響
Positive :
9 µg/ml Paclitaxel 處理 48hr 之後 LNCaP DNA片段化情形
4.5 µg/ml Paclitaxel 處理 48hr 之後 PC-3 DNA片段化情形
5 μg/ml CFK6處理後不同時間內 LNCaP caspase 活性。
LNCaP 癌細胞株在 12 、24 、48 小時反應下 ，M1區增加比例為 8.5 %、10.7 %、34.4 %
5 μg/ml CFK6處理後不同時間內 PC-3 caspase 活性。
PC-3 癌細胞株在 12 、24 、48 小時反應下 ，M1區增加比例為 7.2 %、40.3 %、50.9 %
CFK6 處理 24hr， cytochrome-c、Bax/Bcl-2、FasL、p53 蛋白表現。
CFK6 處理 24hr，LNCaP caspase-3、8、9 蛋白量化表現。(n= 3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK6 處理 24 hr，PC-3 caspase-3、8、9 蛋白量化表現。
(n= 3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK6 處理 24hr ，LNCaP caspase-7 、cytochrome-c 、Bcl-2/Bax 蛋白量化表現。(n= 3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.00
CFK6 處理24hr，PC-3 caspase-7、cytochrome-c、Bcl-2/Bax 蛋白量化表現。(n= 3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK6 處理24hr，LNCaP、PC-3 FasL 蛋白量化表現。(n= 3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
CFK6 處理24hr，LNCaP、PC-3 p53 蛋白量化表現。 (n= 3) *: p<0.05 **: p<0.05 ***: p<0.001
討論
實驗利用管柱層析法將牛樟芝子實體乙醇粗萃物分離，得到 CFK4 與 CFK6 分離物 ， 由 HPLC 圖譜分析 ，CFK4 主要成分是33分鐘的波鋒，以軟體分析後面積的百分比為 56.87%，而 CFK6 主要成分是44.6分鐘的波鋒，以軟體分析後面積的百分比為 66.94%。接著進行細胞存活率測試來評估 CFK4 與 CFK6 是否具有抑制前列腺癌細胞的能力，結果顯示 CFK4 與 CFK6 皆能抑制前列腺癌細胞生長。文獻指出太平洋紫杉醇 ( Paclitaxel )具有抗癌的功效，但在治療癌症上有許多的副作用例如: 胃腸不適、肝臟損傷，嚴重的過敏反應 (王，2000)。實驗使用Paclitaxel 對於前列腺癌細胞株 LNCaP、PC-3 進行細胞存活率測試，實驗結果顯示 Paclitaxel 處理 48hr，前列腺癌細胞 LNCaP、PC-3 IC50 分別為 9.1 μg/ml、4.58 μg/ml，而 CFK6對於前列腺癌細胞 LNCaP、PC-3 處理 24hr， IC50 分別為 10.57 μg/ml、5.42 μg/ml，由以上結果得知 CFK6 對於前列腺癌細胞株 LNCaP、PC-3 具有其發展性。在 2007年 ( Chen et al., 2007 ) 文獻得知牛樟芝子實體的乙醇萃取物能抑制前列腺癌生長，使 LNCaP cell 細胞周期停滯在 G0G1 期，PC-3 cell 停滯在 G2/M期。本實驗結果CFK6 會使前列腺癌細胞 LNCaP cell 停滯在 G0/G1 期，PC-3 cell停滯在 G0/G1 期且有 Sub-G1 peak 產生，經由 DNA 電泳分析可觀測到有其 DNA 片段化現象，因此可以推斷 CFK6 會透過促使前列腺癌細胞走向細胞凋亡而達其細胞毒殺的效果 。 在細胞凋亡路徑測試方面已證實 CFK6 對於前列腺癌 LNCaP、PC-3 主要透過外部訊息傳遞路徑 FasL 的表現來活化下遊 caspase-8 蛋白表現，進而影響粒線體調控路徑 Bax/Bcl-2 的活化促使 cytochrome-c 被釋放，活化下遊的 caspase-9、3 導致細胞凋亡產生。在前列腺癌 PC-3 凋亡路徑結果發現在 CFK6 ( 10 μg/ml ) 處理下 ，caspase-3 、8 、9 、cytochrome-c、FasL 蛋白表現量比 CFK6 ( 5 μg/ml ) 處理下少 ， 得知前列腺癌 PC-3 細胞凋亡最佳處理濃度為 5 μg/ml 。根據文獻顯示，LNCaP 細胞會表現野生型( wild type ) p53，並且會分泌前列腺特異抗原 ( prostate specific antigen, PSA) ( Li et al., 2003)。觀測 p53 腫瘤調控蛋白對於前列腺癌 LNCaP，隨著 CFK6 處理濃度增加而明顯表現；而對於前列腺癌 PC-3，p53 蛋白表現量較不明顯，得知 LNCaP 癌細胞為野生型 p53，因此 p53表現量會來的比 PC-3 癌細胞明顯。
本實驗證明，牛樟芝子實體分離物 ( CFK6 ) 對前列腺癌細胞 LNCaP 及 PC-3，主要凋亡路徑透過外部訊息傳遞路徑 Fas-L 蛋白表現，活化下遊 caspase-8，活化 caspase-8 會走向粒腺體傳遞路徑 Bax/Bcl-2 ， 改變粒腺體膜電位釋放 cytochrome-c ， 來活化 caspase-9、caspase-3，來導致細胞凋亡。而 p53 也參與細胞凋亡路徑，進而活化下遊 Bax，走向粒腺體傳遞路徑導致細胞凋亡
未來展望
本研究證實牛樟芝子實體分離出的 CFK4、CFK6 具有抑制前列腺癌細胞生長的作用。在細胞凋亡路徑測試方面已證實 CFK6 能透過 FasL 的表現來活化下遊 caspase-8 蛋白表現，進而影響粒線體調控路徑 Bax/Bcl-2 的活化促使 cytochrome-c 被釋放，來活化下遊的 caspase-9、3 導致細胞凋亡產生，另外 p53 腫瘤轉錄因子也會伴隨的細胞凋亡產生，而明顯表現。有關於 p53 更進一步探討；
相關論文指出，p53會參與調控並使其 JNK 磷酸化走向活化 JNK 路徑 ( yeh et al., 2001 )，牛樟芝子實體萃取物會因其為細胞膜上 Na+-K+ ATPase 的抑制劑，而提升細胞內鈉離子的濃度，再經由細胞膜上的鈉、鈣離子交換孔道而提升細胞內的鈣離子濃度，進一步造成細胞凋亡 ( Lee et al., 2007 )。在細胞周期調控方面也有相關論文證實 p53 會使其細胞周期停滯在 G0G1 與 G2/M 期，進而活化下遊 Bax、p21 ( Lee et al., 2001 )。在 G0G1 期蛋白調控方面， p53 活化後 ，會使的下遊 p21 被活化進而抑制 CDK4/Cyclin D1 後造成 G1/S 期生長停止導致細胞凋亡，同時並涉及 Cyclin D1 活性之抑制及 pRb 之磷酸化 ( chen et al., 2007 )。在萃取物 CFK4、CFK6 的部份，期望未來能進一步將其純化成單一物質，定出結構。牛樟芝子實體對於前列腺癌症的治療在細胞調亡機制方面尚未完全找出 ， 而在活體方面的研究較少 ， 而這些治療結果須經過長期的動物試驗進而進入人體試驗，才可以真正為病人所使用。
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