在文章（策略篇）S5E07:信號通路研究策略三步驟中，我們總結了信號通路研究的四個層面和三個步驟：從效應到通路，從通路到分子，從分子到序列的分解策略，今天我們分享一篇Nature：AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade in transcriptional regulation of autophagy.Nature. 2016 Jun 15.（下載連結：http://pan.baidu.com/s/1eRTH8fo 密碼：4uhk）。
首先看這文章的題目就很有感覺吧：AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade，大家在寫文章和基金的時候可以學習這種高大上的描述方式哈，其它的說法還有：X/Y/Z Cascade，Axis，「Crosstalk」等等。
比如：Crosstalk 對話
比如： Axis信號軸
其實，看起來高大上的文章題目就是這麼裝B的……
好了，我們正式看這篇文章的機制和通路研究，首先我們把文章的幾個關鍵分子理清楚，紅色的是這個分子的分子功能：
CARM1：co-activator-associated arginine methyltransferase 1精氨酸甲基轉移酶
SKP2：an F-box protein of the SCF E3 ubiquitin ligase complex E3泛素連接酶
AMPK：AMP-activated protein kinase 蛋白激酶
FOXO3a：forkhead family of transcription factors 轉錄因子
TFEB：transcription factor EB 轉錄因子
分子之間的關係是：葡萄糖飢餓——AMPK激活（發揮激酶作用）——FOXO3a磷酸化（發揮轉錄抑制作用）——SKP2轉錄抑制（發揮泛素化蛋白降解作用）—CARM1降解減少（發揮精氨酸甲基修飾作用）——轉錄激活TFEB（發揮轉錄激活作用）——自噬，不得不佩服作者在選擇下遊分子時的考量，牛B！
其實看明白文章的主線後，我們就可以整理成一下幾個主題了；
1. 葡萄糖飢餓引起自噬，導致H3R17me2和CARM1上調。
個人認為：對於這篇Nature來說，這一步是最出彩，也是最關鍵的部分。作者說他們直接觀察到H3R17me2修飾，然後發現精氨酸甲基化酶CARM1表達上調。話說一般人會直接檢測組蛋白17位精氨酸的甲基化修飾嗎？不會。所以我們懷疑：
a. 作者通過質譜進行葡萄糖飢餓處理組、對照組的甲基化修飾蛋白篩選，結果鑑定到這個位點，然後再找到CARM1；
b. 文章是反著做正著寫的，即先通過SKP2找到的CARM1，然後再檢測的精氨酸甲基化修飾；
c. 作者實驗室就是研究組蛋白修飾的，而且對於組蛋白賴氨酸修飾已經研究的差不多了，所以研究下精氨酸修飾是很正常的。
至於具體哪個原因我們就不得而知了，這一步的因素變量是H3R17me2和CARM1，按照上次我們說的看文章的方法（（方法篇）：四步法快速讀文章），具體內容就是針對這三個因素變量的加減法：
2. CARM1上調的原因是由於SKP2表達下調介導的泛素化降解被抑制。
從這一步開始，文章思路難度就開始降低了，如果我們如果遇到這種情況呢，就會考慮CARM1上調的水平是轉錄還是轉錄後，先測定下CARM1的mRNA和蛋白水平後再作判斷，如果mRNA水平也有上調，那麼考慮下甲基化修飾、轉錄激活因子、microRNA等等，這裡作者沒有說mRNA的變化，我們暫不考慮。接下來作者發現蛋白水平有變化了，一般我們也會考慮是翻譯增加還是降解減少。好吧，作者再次直接看蛋白降解，我們一般是這麼來做的：先做CARM1的IP+質譜，篩選下那些蛋白與CARM1結合的蛋白，然後再挑泛素連接酶，於是就出現了SKP2，那麼這裡的因素變量就是SKP2了：
3. SKP2表達下調的原因探索：從AMPK到FOXO3a的確定。
作者闡述這部分結果的時候，是從自噬——AMPK通路對SKP2的表達調控出發的，而FOXO3a的確定是這一步的關鍵。如果我們做到這一步，就會遇到這樣的難題：已知SKP2的表達（mRNA和蛋白）下調，而自噬激活了AMPK信號通路，AMPK是個激酶，AMPK與SKP2兩者之間是沒有直接作用的。那麼很自然的猜想就是：AMPK通過磷酸化某蛋白，激活這個蛋白，而這個蛋白正好能夠下調SKP2 的表達，那麼這個這個蛋白除了是轉錄因子（FOXO3a）外，還有沒有其它可能呢？單純從下調SKP2的表達下調來考慮，選擇還是很多的。比如，作者就排除了蛋白水平降解的影響。
那麼FOXO3a是怎麼找到的呢? FOXO3a上遊與AMPK的關係是通過文獻報導，下遊與SKP2的關係是通過信息學分析：SKP2有 FOXO3a的應答元件（FOXO response element，FRE）。再往下就是證明AMPK對 FOXO3a的磷酸化修飾和 FOXO3a對SKP2的轉錄抑制了。
4. 從CARM1到自噬效應通路探索：H3R17me2——TFEB——自噬相關通路
在確定CARM1下遊通路中，作者用了我們熟悉的RNA-seq方法，並重點分析自噬相關基因，當然，也通過CHIP-seq來確定H3R17me2結合的基因啟動子，再結合文獻報導，從而把TFEB挑選出來。下面就是證明CARM1與TFEB的作用對下遊基因和H3R17me2的影響了，這裡的研究內容包括：CARM1與TFEB的結合，因素變量CARM1、TFEB和H3R17me2的幹預對下遊基因通路的影響。
最後我們簡單回顧一下文章：作者研究的主題是細胞自噬，思路是先尋找到自噬相關的組蛋白甲基化修飾位點H3R17me2和CARM1，然後分別往CARM1的上遊和下遊擴展。上遊看CARM1上調的原因，結果發現介導CARM1降解的泛素化連接酶SKP2表達下調；再往上走，發現SKP2下調的原因是轉錄抑制因子FOXO3a的激活；再往上走，最後發現FOXO3a的激活是由AMPK磷酸化介導，而AMPK通路在自噬過程中被激活是已經廣為認可的了。下遊：從CARM1上調後的結果出發，通過RNA測序、蛋白互作、CHIP、分子抑制劑等發現並驗證了CARM1與TFEB對H3R17me2和自噬相關基因的調控作用。
選分子難，能做出來更難！
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