快速克隆基因,您準備好了嗎?

ATCG不規則的排列組合組成了地球上近870萬個物種形形色色的遺傳物質，而解密其內在調控機制是生物工作者心心念念奮鬥的目標。1977年，噬菌體ΦX174長達5375-bp基因組被第一個測序完成，基因組測序事業開始蓬勃發展，時至今日，NCBI收錄了超過6000個真核生物和150,000個原核生物的測序數據，其中包括禾本科。而基因組研究目的也從單純的科學研究向實踐應用發生著轉換。基因組學和生物技術相結合，包括標記輔助選擇，基因組選擇和基因編輯，已成為育種中不可缺少的工具，功能基因的定位和克隆將會把這種技術的結合作用發揮更大。

禾本科這個神奇的科屬，是全球大部分食品飼料來源，為我們提供了超過50％的卡路裡，它包括小麥，大米，玉米，大麥，高粱和小米等。大約在4500萬至6000萬年前，現代穀物共享了一個共同的祖先，雖然禾本科植物親緣關係較近，但它們的基因組差異比較大，例如，水稻的基因組大小為380M，相當於小麥基因組的2.4%。今天，較多的作物基因組被測序，自2005年水稻基因組測序完成以來，高粱、玉米、大麥、珍珠粟、小麥基因組相繼測序完成，這些高質量的參考基因組是穀物遺傳學和基因組學研究中的裡程碑。

那在基因定位中，參考基因組發揮著什麼樣的作用？如下圖所示，自有參考基因組後，一個簡單的文獻檢索顯示有關水稻、擬南芥「基因克隆」的文章數量已經飆升，而2009年完成的2.3-Gb玉米基因組對克隆基因的數量影響貌似不是不大，這可能因為儘管有高質量的可用性參考序列，大基因組仍然是基因克隆的主要障礙。參考序列只是基因組功能的一個墊腳石，在擁有大而複雜的基因組的物種中仍然需要創新的定位方法。

 

將植物的表型變異與基因組差異聯繫起來，一直是植物研究和育種中的永恆命題，隨著分子標記技術的出現和複雜的統計工具的使用，解剖複雜性狀的遺傳變異成為可能。目前使用最多的兩種方法為QTL定位和GWAS分析，隨著DNA測序的發展，早在20世紀90年代和21世紀初，湧現出RFLP，SSR，SNP等多種不同的分子標記。QTL分析和GWAS均是尋找與性狀連鎖的分子標記，儘管這兩種方法較難直接定位到基因，但對鑑定主要的QTL還是很準確的。圖位克隆也是定位基因的有效方法，利用染色體步移的方法縮小候選基因區段。例如水稻中抗病基因Xa21的克隆。Xa21來源於非洲野生稻，1992年，應用RFLP和RAPD標記將Xa21定位到11號染色體1.2-cM處。1995年利用連鎖標記篩選BAC文庫，將Xa21定位至9.6kb區段內找到了功能基因。Xa21最早是發現於1985年，而它的定位克隆完成發生在10年後，由此來看，圖位克隆是定位基因的有效方法，但在沒有參考基因的情況下，還是很費時費力費成本的。