蘇雲金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種具有特異殺蟲活性的細菌,能產生多種對昆蟲有特異活性的殺蟲蛋白,包括cry和cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins,簡稱ICPs),以及營養期分泌的殺蟲蛋白Vip(vegetative insecticidal protein,簡稱Vips)。
從1938年起,Bt被大規模開發成微生物殺蟲劑用於害蟲防治,取得了良好的經濟效益與生態效益。自1996年起,導入Bt特異抗蟲基因的轉基因作物被批准商業化種植,2013年全球棉花、玉米等多種抗蟲轉基因作物總種植面積達到了7000萬公頃(折合10.5億畝)。Bt抗蟲基因巨大的應用價值和市場開發前景引起國內外相關研究機構和企業的高度關注,不斷加大投入,進行殺蟲基因新資源的發掘和保護,這一領域的競爭也越加激烈。
長期以來,多種分子生物學方法被用於Bt殺蟲基因的鑑定與克隆。最先發展起來的是基於蛋白質分析的克隆方法。該方法通過純化獲得具有殺蟲活性的蛋白質,進一步利用蛋白測序技術獲得部分胺基酸序列,再通過基因組文庫或PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈式反應,一種用於放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術)等基因組步移技術獲得全部編碼殺蟲蛋白的DNA序列。該技術以殺蟲蛋白為研究分析對象,以功能活性為檢測依據,是對Cry蛋白進行鑑定最直接、最有效的方法,可以獲得全新的殺蟲基因,第一個Bt殺蟲基因就是利用該技術克隆獲得的。但是由於該技術存在純化費用昂貴、步驟繁瑣、操作複雜等問題,目前已較少使用。
與蛋白質分析的克隆方法相比,基於PCR技術的殺蟲基因鑑定克隆方法具有廉價、便捷、快速等優點,已經被廣泛用於殺蟲基因鑑定與克隆。中國農業科學院植物保護研究所優化了基於PCR-RPLP(聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態性)技術的殺蟲基
因鑑定克隆體系,首先通過生物信息軟體在一定的基因群體範圍內定位基因保守區域,並設計適用於某特定類群殺蟲基因的通用引物,進行PCR擴增,獲得菌株樣品含有基因片段,進一步通過限制性酶切分析酶切圖譜差異、熔解曲線分析DNATm值差異或利用測序儀直接測定序列差異的方法對殺蟲基因進行鑑定。優化後的基因鑑定方法提高了殺蟲基因鑑定的精度,拓寬了檢測範圍。近三年來基於高通量基因組測序的Bt殺蟲基因克隆技術快速發展。該方法通過高通量測序、拼接獲得菌株基因組序列,進一步通過基因預測與比對,篩選獲得殺蟲基因序列,不僅可直接獲得殺蟲基因序列,而且各步驟過程易於實現自動化,應用前景更加廣闊。
近年來中國農業科學院植物保護研究所利用上述技術鑑定克隆,並獲國際Bt殺蟲基因命名委員會的正式命名的Bt殺蟲基因達到126個(cry基因106個,vip基因21個)。其中包括創新性突出、應用價值高、具有自主智慧財產權的模式基因,如對鱗翅目害蟲高效的cry1Ah1、cry1Ie1、cry2Ah1、cry9Ee1,對鞘翅目害蟲高效的cry8Ea1、cry8Ga1、cry8Ha1、cry8Ia1等;相關殺蟲基因申請國家發明專利33項,獲得專利授權23項。目前該所已與中國科學院遺傳發育所、中國農業大學、中國農科院生物技術所、、作物所、蔬菜所、大北農集團、奧瑞金公司、中種集團等十餘家高等院校、研究院所和知名企業合作,開展抗蟲玉米、水稻、棉花、大豆、甘藍等作物的研究開發。
Bt殺蟲基因國際命名委員會網站迄今公布的cry基因總數已達775個,vip基因117個。值得一提的是近五年(2009-2014)各國Bt新基因發掘速度不斷加快,全球新發現了322個cry基因、60個vip基因,其中165個cry基因、37個vip基因來自中國,佔新基因總數的一半以上,顯示了中國功能基因研究自主創新的飛速進步和強大實力。
目前,由中國農業科學院植保所主導,與國際Bt殺蟲基因命名委員會、英國Sussex大學、美國Ohio州立大學等國外專家合作,正在著手全球Bt殺蟲基因、蛋白活性、菌株等數據信息資源的整合工作,相關資料庫有望在今年10月份在中國建立和正式公開。中國的Bt研究將進一步走向世界,為推動全球殺蟲微生物和生物技術研究做出更大貢獻。(生物谷Bioon.com)